Фолликул волоса: Наука: Наука и техника: Lenta.ru

Система хронобиологического контроля, управляющая циклическими процессами в волосяном фолликуле, остается предполагаемой.Контроль начала и продолжительности любой фазы цикла волос сложен. Возможно, они включают серию синхронизаторов с повышающей и понижающей регулировкой. Весь процесс поддерживает рост волос, переходя от одной стадии роста в цикле роста волос к следующей [12].

Во время круговорота волос задействован ряд типов и структур клеток. Они включают эндотелиальные клетки, лимфоциты, базальные мембраны, протеогликаны и прилегающие конститутивные клетки эпидермиса, дермы и гиподермы [14]. Возможно, они влияют на цикл. Не установлено, являются ли некоторые из этих изменений причинными или сопутствующими признаками. Наиболее очевидная движущая сила в цикле роста волос исходит как от фолликулярного сосочка, так и от перифолликулярного матрикса. Действительно, во время цикла роста волос в этих структурах происходят заметные структурные изменения. Фолликулярный сосочек в установленном анагене имеет большие размеры. В телогене он становится меньше и компактнее. Размер фолликулярного сосочка определяет размер и форму фолликула [14–16], которые, в частности, определяются расположением тела.Различные размеры сосочков во время цикла роста волос отражаются во внеклеточном матриксе, ремоделируясь с накоплением протеогликанов, включая версикан [17]. Сосудистые структуры становятся более заметными в фазе роста. Факторы папиллярных мезенхимальных клеток, вероятно, действуют на фолликулярный эпителий. В начале фазы анагена факторы сосочка влияют на стволовые клетки волосяного фолликула, которые восприимчивы к индуктивным сигналам [18].

3. Координация между последовательными циклами волос

У субъектов с пониженной густотой волос большинство фолликулов содержат только один волос, а некоторые другие кажутся пустыми [19].Напротив, в условиях пухлости фолликулы обычно содержат пару волосков. Этот аспект, возможно, связан с тем, что несколько волосяных фолликулов совместно используют один воронок. Дальнейшее влияние на этот паттерн оказывает замедленный телоптоз [13]. Телоптоз может возникать одновременно с тем, что волосяной фолликул инициирует следующую раннюю стадию анагена или уже некоторое время находится в анагене.

Напротив, в некоторых условиях волосы телогена теряются до того, как становятся видимыми волосы следующего анагена.В латентный период волосяной фолликул при клиническом осмотре кажется пустым [20–22]. Время задержки перед экструзией волос следующего поколения соответствует феномену затмения волос [22]. Эта физиологическая особенность более или менее продолжительна, в среднем достигая 4-7 месяцев [20, 23]. Очевидно, это влияет на густоту волос на коже головы. Феномен затмения волос, вероятно, зависит от ряда различных синхронизаторов. Это является результатом некоторых нарушений в циклическом движении волос, включая ранний телоптоз, задержку начала анагена или задержку роста волос на любом этапе во время стадии анагена.Таким образом, феномен затмения волос представляет собой беспорядочный процесс, происходящий в ряде физиопатологических состояний, влияющих на волосяные фолликулы по отдельности или в фокусе или в общих формах. Это чаще возникает после синхронного телоптоза, возникающего при телогеновой алопеции, такого как послеродовая алопеция. Локальные синхронизаторы, включая факторы роста и другие медиаторы, в конечном итоге отсутствуют или участвуют в феномене затмения волос. Их идентификация и характеристика могут привести к появлению новых корректирующих и профилактических применений.

Основные причинные механизмы феномена генерализованного затмения волос, вероятно, разнообразны. Они остаются неурегулированными. Два типичных примера представлены остановкой роста волос во время фазы миданагена при очаговой алопеции и временным облысением, возникающим у некоторых новорожденных или после химиотерапии. За хроническим оттоком телогена [21] также следует феномен затмения волос. Разнообразие причин и механизмов, участвующих в феномене волосяного затмения, примечательно [5, 20].

4. Послеродовое выпадение волос

Большинство женщин страдают от выпадения телогена в послеродовом периоде [1, 24, 25]. Действительно, во время беременности фаза телоптоза / экзогена задерживается, и количество выпадающих волос уменьшается, вызывая увеличение пухлости волос. После родов циклы волос на коже черепа у этих женщин синхронизируются, что приводит к синхронному процессу телоген-телоптоза [26]. В то время выпадение волос кажется обильным, но представляет собой только устранение дополнительных волос, которые поддерживались в фазе анагена и не были потеряны во время беременности. Во второй и третьей четверти беременности только около 10% волос находятся в телогене.

Послеродовое выпадение волос является обычным явлением и считается незначительным неудобством для женщин, которые ранее прошли через это. Тем не менее, это, возможно, представляет собой паническое состояние для тех, кто испытывает это впервые. Тот же процесс действует при тяжелых лихорадочных состояниях. В течение первых недель послеродового периода волосы поступают в телоген синхронной волной, достигая в среднем 30% через девять недель.Это объясняет клиническое наблюдение, согласно которому послеродовое выпадение волос происходит через два-четыре месяца после родов. Обычно это продолжается от 6 до 24 недель, но редко длится до 15 месяцев.

Послеродовое выпадение волос на коже черепа диффузное, но выражено по передней линии волос. Практически все волосы заменяются через несколько недель, если какой-либо другой процесс не разоблачает женское облысение.

5. Волосяные фолликулы во время климактерического периода

Средний возраст естественной менопаузы составляет около 49–51 лет. Часто в этот период жизни поражаются волосяные фолликулы. В самом деле, волосы представляют собой особую рецепторную структуру, выражающую снижение, связанное с колебаниями циркулирующих уровней половых стероидов. Двумя основными изменениями в распределении волос, наблюдаемыми в период менопаузы, являются алопеция по женскому типу (FPA) и лицевой гирсутизм. Оба состояния часто бывают сопутствующими и становятся более выраженными с возрастом в постменопаузальный период. Сообщалось, что тиболон как альтернатива заместительной гормональной терапии (ЗГТ) увеличивает тяжесть диффузной алопеции и, возможно, вызывает гипертрихоз лица [27].Фронтальная фиброзная алопеция (FFA) – это отдельное состояние, которое, вероятно, усугубляется менопаузой, хотя оно не контролируется с помощью ЗГТ.

6. Климактерическое выпадение волос

Большинство женщин в развитых странах ожидают, что после менопаузы проведут треть или более своей жизни. Старение, связанное с климактерическими гормональными изменениями, обычно влияет на некоторые характеристики волос и является причиной уменьшения покрытия волос у женщин среднего возраста [28]. Наиболее распространенной формой прогрессирующей алопеции у пожилых женщин является FPA, которая часто ухудшается во время перименопаузы, особенно если это состояние присутствовало ранее [29, 30].Уменьшение продолжительности фазы анагена и регресс волос на коже головы до более тонких пушковых волос вызваны, в частности, андрогенами. Обычно они приводят к климактерической алопеции [23]. Следует отметить, что у некоторых женщин с алопецией не наблюдается повышения уровня циркулирующих андрогенов, что позволяет предположить, что у них много андрогенных рецепторов кожи или задействованы другие андроген-независимые механизмы [29]. FPA особенно влияет на волосяные фолликулы в теменной и лобно-сагиттальной областях, вызывая истончение битемпоральных волос, но оставляя нетронутой переднюю линию роста волос [29, 31].В этом состоянии как роговой слой кожи головы, так и стержни волос показывают пониженный уровень емкости, указывающий на нарушение увлажнения [32, 33].

Постменопаузальная СЖК представляет собой отчетливую рубцовую алопецию [34–36]. Это соответствует прогрессирующему состоянию, ответственному за разрушение верхней части волосяного фолликула инфильтратом лимфоидных клеток. Этот процесс вызывает характерный узор разрежения волос, соответствующий симметричной регрессии лобной и височной линии роста волос в сочетании с частичной или полной потерей бровей [34–36].Начало выпадения волос особенно сложно идентифицировать, поскольку пациенты обращаются к врачу относительно поздно во время прогрессирования заболевания. Следовательно, FFA часто стабильна, и это влияет на эффективность лечения [25, 36]. Кроме того, остается нерешенным вопрос о том, как климактерические изменения вызывают это избирательное воздействие на лобно-височную часть кожи головы. Однако сообщалось о некоторой пользе у нескольких пациентов после андроген-зависимой терапии [24, 26, 35].

7. Беременность и климактерический гирсутизм на лице

Повышенный рост волос во время беременности – редкое состояние, связанное с признаками вирилизации, такими как низкий голос, прыщи и увеличение клитора. У некоторых из этих пациенток была обнаружена арренобластома, а у других женщин двустороннее увеличение яичников является результатом гиперплазии лютеиновых клеток. Вирилизация, возможно, исчезает в послеродовом периоде в связи со спонтанным уменьшением размера яичников.

Волосы на теле у женщин обычно имеют тенденцию расти до наступления менопаузы. В дальнейшем он начинает уменьшаться. Напротив, волосы на лице имеют тенденцию увеличиваться даже у пожилых людей. Распространенность гирсутизма у женщин в постменопаузе полностью не задокументирована [37].Около 50% женщин сообщают о чрезмерном росте волос на лице после менопаузы [38]. Эта особенность свидетельствует о том, что во многих случаях недооценивается как клиническое, так и социальное значение этой проблемы.

В целом гирсутизм возникает из-за повышенной выработки андрогенов или повышенной чувствительности волосяных фолликулов к этим гормонам [39]. Андрогены отвечают за увеличение размера волосяного фолликула, диаметра стержня волоса, продолжительности фазы анагена терминальных волос и выработки кожного сала. Все эти аспекты обычно присутствуют при гирсутизме [40].Подавляющее большинство женщин с волосатым волосом страдают доброкачественным причинным заболеванием. Двумя основными причинами являются синдром поликистозных яичников (СПКЯ) и идиопатический гирсутизм с уровнем циркулирующих андрогенов в пределах нормы [41–45]. Хотя СПКЯ и связанный с ним гормональный дисбаланс наблюдались после менопаузы, уровень гиперандрогении был скромным.

Более серьезные, но редкие причины гирсутизма включают врожденную гиперплазию надпочечников и синдром Кушинга, а также некоторые доброкачественные и злокачественные андроген-секретирующие опухоли яичников и надпочечников [38, 46, 47].Сообщалось о гиперандрогении, вызванной ганглионевромой надпочечников [48], и гиперандрогении, связанной с яичниками, связанной с гирсутизмом, включая гипертекоз яичников [49–51] и новообразования яичников [52]. Тяжелая вирилизация незлокачественного происхождения у женщин в постменопаузе встречается редко. Иногда гирсутизм в постменопаузе следует за андрогенной терапией, включая терапию тестостероном [53] и терапию андроген-эстрогеном [54].

8. Заключение

Подчеркивая уникальность некоторых заболеваний волос у женщин, эти заболевания и их лечение должны стать предметом более пристального внимания.Конечная цель – лучше предотвращать, диагностировать и лечить заболевания волос у женщин. Причины гирсутизма и выпадения волос, а также лечение этих состояний иногда отличаются у женщин в постменопаузе по сравнению с женщинами более молодого репродуктивного возраста [55]. Некоторые женщины в постменопаузе, вероятно, заслуживают особой заботы и внимания, вступая в новую фазу своей жизни, поддерживаемую сложными физиологическими изменениями. Хронобиология, регулирующая цикл волос, – увлекательный и сложный процесс.

Благодарности

Работа поддержана грантом «Fonds d’Investissement de la Recherche Scientifique» университетской больницы Льежа. Никакие другие источники финансирования не использовались для подготовки этого документа. У авторов нет конфликта интересов, имеющего прямое отношение к содержанию обзора. Авторы признательны г-же Иде Леклерк и Мари Пульезе за прекрасную секретарскую помощь.

Дермальная конденсация волосяного фолликула образуется через выход примированного Fgf20 клеточного цикла, подвижность клеток и агрегацию

Существенные изменения:

1) Введение и обсуждение.Рецептор нейротрофина p75 кДа необходимо включить в список ранних маркеров конденсата мезенхимальных клеток, и необходимо указать соответствующую рукопись (PMID: 10588868). Фактически, удаление p75NTR приводит к усилению регуляции FGFR2 в фолликулярном сосочке, обеспечивая тем самым функциональную связь между передачей сигналов p75NTR и FGF в мезенхимальных клетках.

Спасибо за предложение. Мы упомянули p75NTR в списке ранних маркеров дермального конденсата во Введении и процитировали статью (второй абзац).Интересно отметить, что делеция p75NTR приводит к усилению регуляции Fgfr2, и, безусловно, может быть, что устранение Fgf20 приводит к отсутствию p75NTR и усилению регуляции Fgfr2, однако мы не тестировали ни одну из этих молекул и, следовательно, не хотели бы спекулировать на этой связи. в этой рукописи.

2) Рис. 2. Чтобы лучше обосновать отсутствие потенциального вклада Sox2 ⁺ Шванновских клеток в образование мезенхимального конденсата, авторы могли бы пожелать процитировать данные, показывающие отсутствие Шванновских клеток, связанных с нервными волокнами в E14.5 дермы мыши (PMID: 12012374).

Благодарим рецензентов за это предложение. Однако благодаря открытию Fgf20 в качестве раннего маркера волосяного фолликула и использованию маркера нейрофиламентов 2h4 и маркера предшественника шванновских клеток Sox2 мы наблюдаем сторожевые волосяные фолликулы уже в коже мышей E13.5 с тесно связанными нервными волокнами, слегка украшенными -окрашенные клетки Sox2 ⁺ (см. стрелки на изображении ответа автора 1, масштабная линейка = 10 мкм). Это открытие согласуется с профилем RNAseq E14.5 на коже эмбриона (www.hair-GEL.net, PMID: 26256211), показывающая присутствие Sox2 ⁺ шванновских клеток во время индукции первичного волосяного фолликула.

3) Рисунки 4 и 6. Миграция эпителиальных клеток связана с усилением иммуноокрашивания фаллоидином сети эндогенных актиновых филаментов. Есть ли шанс продемонстрировать такую ​​сеть в фибробластах, участвующих в образовании конденсата мезенхимальных клеток?

Это отличный момент.Мы использовали Sox2-GFP для идентификации как клеток DC, так и мигрирующих клеток DC, и сравнили актиновую сеть этих клеток за пределами DC с фибробластами, отличными от DC. Эти данные были добавлены в качестве рисунка 4 – рисунок в приложении 2A, B. Мы наблюдали увеличение интенсивности окрашивания F-актина в клетках Sox2 ⁺ за пределами DC по сравнению с фибробластами Sox2-non-DC, что, вероятно, указывает на их миграционный статус. Интересно, что мы наблюдали еще более высокую интенсивность окрашивания F-актина в клетках Sox2 ⁺ DC.Мы далее сравнили интенсивность окрашивания фаллоидином в DC и сравнили его с соседней мезенхимой, отличной от DC, и обнаружили, что оно было значительно увеличено в DC на всех этапах, изученных в этом исследовании (новый рисунок 4 – приложение к рисунку 2C, D ). В нашем анализе живой ткани эти клетки показали пониженную подвижность (рис. 4D, F), и вполне вероятно, что F-актин в этих клетках участвует в поддержании трехмерной структуры DC.

4) Количество мышей, использованных для каждого эксперимента, четко не указано (за исключением анализа RNAseq).Множественные плакоды должны быть исследованы на множестве мышей, чтобы учесть различия между животными. Учитывая небольшое количество изученных плакод, кажется вероятным, что во многих экспериментах использовалось только одно животное. Незначительный момент. Для большинства экспериментов было неясно, из какого числа взяты наборы данных об эмбрионах. В частности, на рисунке 4 количество отслеживаемых клеток кажется низким, и неясно, отслеживались ли несколько фолликулов. Укажите n значений для # ячеек в # плакодах и # эмбрионах.

Мы согласны с тем, что это может вызывать беспокойство, и приносим свои извинения за то, что не сообщили о размерах выборки в достаточных подробностях. В каждом эксперименте мы использовали несколько эмбрионов. Мы предоставили количество эмбрионов, количество плакод и количество клеток, использованных в легенде каждого рисунка.

5) Поскольку исходный цветовой контраст Fucci не так хорош, как более поздние версии мышей, следует использовать дополнительный метод для подтверждения выхода из клеточного цикла (например, окрашивание фосфогистоном h4 или короткая погоня после введения аналога тимидина).

Мы исследовали модель Fucci2a (Mort et al., 2014), второе поколение мышей-индикаторов клеточного цикла, во время морфогенеза DC и находим результаты, согласующиеся с результатами, полученными с исходным штаммом Fucci (подраздел «Образование дермального конденсата связано с выход из клеточного цикла », первый абзац, и репрезентативные цифры показаны на новом рисунке 3 – рисунок в приложении 1). Кроме того, мы провели 2-часовые импульсы EdU и количественно определили процент клеток EdU ⁺ в популяции клеток Sox2 ⁺ DC.На стадии I плакоды в среднем 18% клеток Sox2 ⁺ были EdU ⁺ , тогда как на стадиях II-IV плакод наблюдали очень мало клеток EdU ⁺ , что соответствует данным Fucci. Данные EdU были добавлены на рисунок 3 в виде панелей F и G и в результаты (в последнем абзаце вышеупомянутого подраздела).

6) Поскольку SU5402 является широким ингибитором (VEGFR2, FGFR1, PDGFRB), необходимы другие средства контроля, чтобы продемонстрировать, что результаты исследований кожных эксплантатов не являются результатом передачи сигналов Pdgf или Vegf или других молекул FGF, особенно потому, что% клеток Sox2 ⁺ снижалось в ответ на обработку SU5402.

Мы благодарим рецензентов за то, что они подняли этот вопрос. Значения половины максимальной ингибирующей концентрации (IC ₅₀ ) для областей SU5402 указаны в таблице ниже. Основываясь на нашем опыте, более высокие концентрации необходимы для ингибирования рецепторов в экспериментах на культуре органов. Мы использовали SU5402 в концентрации 20 мкМ для достижения описанного эффекта; при 10 мкМ мы не наблюдали никакого эффекта на образование плакод / ​​DC (n = девять кож) (данные не показаны). Значения IC ₅₀ показывают, что ингибирование PDGFRβ достигается при концентрации SU5402 в 17 раз большей, чем при ингибировании FGFR.Кроме того, условная делеция как PDGFRβ, так и PDGFRα в развивающейся дерме и особенно в дермальном конденсате во время морфогенеза волосяного фолликула не приводит к фенотипу (Rezza et al., 2015). Таким образом, мы считаем маловероятным, что результаты будут вызваны ингибированием передачи сигналов Pdgf.

Мы согласны с тем, что потенциальное ингибирование передачи сигналов Vegf вызывает беспокойство. Поэтому мы использовали ингибитор, который более специфичен для FGFR (BGJ398; см. Таблицу ниже для значений IC ₅₀ ) и обнаружили, что аналогично SU5402, в E13.5 эксплантатов обрабатывали в течение 24 часов, ДК не развивались, а рисунок плакод напоминал модель Fgf20-KO. Кроме того, мы использовали специфический ингибитор VEGFR (кабозантиниб, XL184). При концентрации, эквивалентной 20 мкМ SU5402 (на основании значений IC ₅₀ ), т.е. 50 нМ, мы не обнаружили влияния на образование DC или эпителиальный паттерн. Даже 5-кратное повышение концентрации (250 нМ) не влияло на формирование плакод / ​​DC. IC ₅₀ значения ингибиторов и репрезентативные цифры этих данных теперь доступны на Рисунке 7 – рисунки 2 и 3, соответственно.Основываясь на этих данных, мы заключаем, что эффект SU5402 обусловлен ингибированием передачи сигналов Fgfr, и обеспечиваем подтверждение роли передачи сигналов FGF в морфогенезе DC.

7) Нерешенный вопрос – сроки и порядок событий при формировании ДЦ. Из данных, представленных на рисунках 2 и 3, кажется, что фибробласты сначала перемещаются в область DC посредством миграции / агрегации, затем включают экспрессию Sox2 и выходят из клеточного цикла. Или они выходят из клеточного цикла, начинают мигрировать, а затем включают экспрессию Sox2? Хотя авторы подчеркивают преимущество использования визуализации в реальном времени для документирования образования постоянного тока, оно используется только в одном эксперименте (рис. 4), но это позволило бы установить порядок событий в процессе.

Согласны, что это очень интересный вопрос. В наших первоначальных экспериментальных экспериментах с интервальной съемкой использовались трансгены Fucci G ₁ , Fucci S / G ₂ / M и Sox2-GFP, однако мы не чувствовали, что можем надежно отличить Sox2-GFP от Azami Green. в Fucci S / G ₂ / M, в частности в клетках, экспрессирующих низкие уровни Sox2-GFP. Из-за этих технических проблем и с учетом того, что эти ткани являются трансгенными репортерами, мы неохотно делаем какие-либо убедительные выводы относительно порядка событий на основе наших покадровых данных.

Чтобы решить этот вопрос, мы сравнили процент клеток Fucci-G ₁ DC (т. Е. Sox2-положительных клеток) на прогрессирующих стадиях плакод (рис. 3B) и обнаружили, что значительно меньше клеток Sox2 ⁺ DC являются Fucci- G1 положительный на стадии I плакоды по сравнению с более поздними стадиями плакоды (p _{I vs II} = 0,0211; p _{II vs III} = 0,8303, p _{III vs IV} = 0,1579). Кроме того, наш новый анализ EdU в Sox2, экспрессирующих клетки DC, показывает аналогичные результаты (новые рисунки 3F и G).Основываясь на этих данных, мы заключаем, что приобретение судьбы DC (оцениваемое по положительности Sox2) предшествует выходу из клеточного цикла. Мы добавили одно предложение по этому поводу в разделе «Результаты»: «Кроме того, процент непролиферирующих клеток на стадии I DC был значительно ниже, чем на следующих стадиях (p _IvsII = 0,0211), предполагая, что приобретение судьбы DC происходит до выхода из клеточного цикла. . » Мы надеемся ответить на этот важный вопрос в будущих исследованиях с помощью более сложных инструментов.

8) На фиг. 6 показано, что добавления FGF к культивируемым фибробластам достаточно для увеличения скорости миграции, но верно ли это in vivo, неизвестно.Эксперименты с шариками несколько неубедительны – хотя шариков, покрытых FGF, достаточно для индукции экспрессии некоторых генов-мишеней, эффект слишком кратковременный, чтобы отслеживать миграцию.

Похоже, что Fgf20 достаточно, чтобы вызвать изменения плотности клеток и формы клеток в клетках, расположенных рядом с шариком. Меня беспокоят разные размеры шариков в контрольных и экспериментальных образцах, показанных на рис. 6D и 6F – кажется, окружность шарика / площадь поверхности могут повлиять на локальную плотность и форму ячеек.Кроме того, я считаю, что метки на рис. 6E перевернуты. Согласно графику, BSA имеет больше клеток / мкм2, чем Fgf20, но можно сделать вывод, что Fgf20 увеличивает плотность клеток.

Мы приносим свои извинения за то, что не уточнили, что размер шариков, используемых в эксперименте, варьируется от 70 до 100 мкм в диаметре; мы добавили эту информацию в раздел «Материалы и методы». Бусы выбирались случайным образом для каждого эксперимента. Мы ретроспективно измерили диаметр всех шариков, используемых в этом эксперименте, и мы не обнаружили статистической разницы между гранулами, нагруженными FGF20 или FGF9, и их контролями.Диаметр гранул составлял (AVR ± S.D.): FGF20 = 87 ± 10 мкм, BSA (контроль для FGF20) = 85 ± 10 мкм, FGF9 = 87 ± 7 мкм и BSA (контроль для FGF9) = 86 ± 11 мкм. Согласно парному двустороннему T-критерию Стьюдента, гранулы, нагруженные FGF20 и FGF9, существенно не отличались от их контроля BSA (P ^FGF20-BSA = 0,736 и P ^FGF9-BSA = 0,923; n ^{FGF20- BSA} = 9 пар, n ^FGF9-BSA = 7 пар). Мы изменили изображение на рис. 6D и F, чтобы лучше соответствовать среднему размеру бусинок и избежать каких-либо недоразумений.

Приносим извинения за переворот этикеток на Рисунке 6E. Мы исправили ошибку.

9) Fgf20 на выходе из клеточного цикла. Данные хорошо показывают, что Fgf20 необходим для экспрессии p21 in vivo , но достаточно ли этого? Если гранулы, покрытые Fgf20, встроены в дерму Fucci, достаточно ли этого, чтобы вызвать выход из клеточного цикла?

Чтобы решить эту проблему, мы выполнили дополнительные 3-часовые эксперименты с бусинами на интактной мезенхиме. Используя антитело p21, мы не обнаружили никаких положительных клеток рядом с шариком.В дополнение к полной гибридизации in situ мы также использовали зонд, меченный ³⁵ S, в срезах и не обнаружили индукции p21 вокруг шариков, покрытых FGF20 или FGF9. Также не удалось обнаружить значительного эффекта в процентном отношении клеток Fucci-G1 + вокруг FGF20 или FGF9 гранул. Таким образом, оказывается, что одного Fgf20 недостаточно для индукции p21 и выхода из клеточного цикла, и могут потребоваться дополнительные сигналы. В качестве альтернативы кинетика индукции p21 может быть медленнее, чем у ингибиторов обратной связи пути, таких как Spry4 и Dusp6.

Генерация первичного рисунка волосяных фолликулов

Абстрактные

Волосяные фолликулы расположены через кожу на равном расстоянии друг от друга. Хотя фолликулы являются преимущественно эпидермальными структурами, классические эксперименты по рекомбинации тканей показали, что нижележащая дерма определяет их местоположение во время развития. Хотя многие молекулы, участвующие в формировании волосяных фолликулов, были идентифицированы, молекулярные взаимодействия, которые определяют эмерджентное свойство формирования рисунка, остаются неуловимыми.Мы использовали культуры эмбриональной кожи, чтобы проанализировать сигнальные реакции и результаты формирования паттерна по мере того, как кожа организует себя в пространстве. Мы обнаружили, что взаимодействие между рецептором эктодисплазина (Edar) и морфогенетическим белком (BMP) и транскрипционными взаимодействиями играет центральную роль в генерации первичного паттерна волосяных фолликулов, при этом ключевым фактором в этом процессе является ограничение реакции, а не локализация индуцирующего лиганда. . Суть этого механизма формирования паттерна – это быстрая Edar-положительная обратная связь в эпидермисе, связанная с индукцией дермального BMP4 / 7 .BMP, в свою очередь, репрессируют эпидермальный Edar и, следовательно, судьбу фолликула. Активация Edar также индуцирует фактор роста соединительной ткани, ингибитор передачи сигналов BMP, позволяющий действовать BMP только на расстоянии от места их синтеза. В соответствии с этой моделью, трансгенная гиперактивация передачи сигналов Edar ведет к повсеместному перепроизводству волосяных фолликулов. Этот механизм активации-ингибирования Edar-BMP, по-видимому, работает вместе с лабильным препаттерном, подтверждая, что Edar-обеспечиваемая стабилизация активных фокусов β-catenin является ключевым событием в определении местоположения дефинитивных фолликулов.

Периодические узоры – повторяющаяся тема в анатомической организации. Примеры у различных организмов включают щетину насекомых, волосы млекопитающих, расположение листьев на растении и расположение устьиц на этих листьях. Во всех этих случаях положение каждого элемента в шаблоне определяется относительно других, а не абсолютного анатомического расположения. Поскольку регулярные паттерны так широко встречаются в природе, ключевой вопрос биологии развития состоит в том, как можно создать упорядоченный массив структур из изначально однородного поля клеток.В общих чертах такие паттерны могут быть сгенерированы с помощью двух сигналов с разным диапазоном действия (1, 2). Эти системы активации-ингибирования полагаются на активатор, который способствует ( i ) его собственному синтезу, ( ii ) предположению о данной клеточной судьбе и ( iii ) синтезу ингибитора этой судьбы. Решающим в создании пространственного паттерна является то, что активатор действует локально, тогда как ингибитор действует на расстоянии от места его образования. Предполагается, что эти типы молекулярных взаимодействий способны генерировать периодический паттерн за счет усиления стохастической асимметрии в начальных концентрациях активатора и ингибитора (1).

Клетки на поверхности эмбрионов млекопитающих способны стать либо волосяным фолликулом, либо поверхностным эпидермисом. Они координируют свой выбор судьбы, чтобы получить точечный рисунок фолликулов, полагаясь на общение внутри кожи, а не на какую-либо внешнюю информацию о местоположении. Рекомбинация эпидермальных и дермальных компонентов эмбриональной кожи установила, что связь между этими клеточными слоями абсолютно необходима для инициации развития волос и перьев и что дерма ответственна за индукцию морфологических изменений эпидермиса (3, 4).

Многие молекулы, которые играют роль в развитии волосяных фолликулов, были идентифицированы (5-8), но регуляторные отношения между сигнальными путями, участвующими в этом процессе, в значительной степени неизвестны. Это особенно важная проблема, потому что именно взаимодействия между молекулами, а не внутренняя функция какого-либо отдельного генного продукта, ответственны за организацию формирования паттерна. Один такой сигнальный путь, состоящий из внеклеточного лиганда эктодисплазина (Eda), его рецептора Edar и его цитоплазматического сигнального адаптера, связанного с Edar доменом смерти (Edaradd), необходим для развития определенного подмножества волосяных фолликулов.Мутация любого из этих трех генов, каждый из которых специфически экспрессируется в эпидермисе, вызывает идентичные фенотипы эктодермальной дисплазии у мышей и людей (9-12). Этот фенотип включает полное отсутствие первичных волосяных фолликулов, которые у мышей образуются между 13-м и 16-м днем ​​эмбриона. Похоже, что мутантный эпидермис Edar сохраняет свое первоначальное состояние до E17, когда начинают развиваться вторичные фолликулы (10, 13). Формирование вторичных фолликулов имеет отчетливую генетическую основу с мутациями в Noggin (14) или Lef1 (15), что позволяет инициировать первичный волосяной фолликул, но блокирует вторичные фолликулы.

Здесь мы изучаем роль пути Edar в формировании паттерна фолликулов с использованием культур эмбриональной кожи. Система культивирования позволяет проводить краткосрочные эксперименты с определенной начальной точкой. Эта особенность особенно важна для изучения сигнальных реакций, потому что она может отличить проксимальные эффекты экспериментальной манипуляции от тех, которые являются вторичными последствиями, вызванными изменением судьбы клеток. Мы обнаружили, что пространственная организация в эпидермисе достигается за счет модуляции восприимчивости к сигналам, при этом взаимодействия активации-ингибирования Edar-bone morphogenetic protein (BMP) управляют процессом формирования паттерна.

Результаты

Ограничение реакции Eda регулирует плотность волосяных фолликулов.

Хотя системы активации-ингибирования обычно полагаются на дифференциальную доступность лиганда, лиганд в этой системе, Eda, является плохим кандидатом для передачи позиционной информации. Eda широко экспрессируется в эпидермисе (13) и при применении в диффузной форме позволяет формировать паттерн в культуре (16), а in vivo (17).Следовательно, мы рассматривали динамическую экспрессию Edar как средство для генерации паттерна судьбы точечных клеток. Перед инициированием волосяного фолликула Edar равномерно экспрессируется через кожу, но по мере появления паттерна он становится активированным в зачатках фолликула и подавляется в окружающих клетках. Само это динамическое выражение зависит от передачи сигнала Эдара, потому что оно не наблюдается в Edaradd ^{– / –} эмбрионов (рис.1 А ).Таким образом, по мере формирования паттерна клетки отображают одно из трех состояний экспрессии; те, у кого не определяется Edar , вероятно, исключены из судьбы волосяного фолликула, те, у кого высокий уровень экспрессии, преданы этой судьбе, а те, у кого умеренная экспрессия, остаются компетентными для принятия любой судьбы. Количественная ОТ-ПЦР (кПЦР) выявила, что кожа Edaradd ^{– / –} эмбрионов экспрессируют такое же количество Edar , что и у их гетерозиготных однопометников (рис.1 В ). Этот результат показывает, что, хотя формирование паттерна резко реорганизует экспрессию Edar , оно уравновешивает фокальную повышающую регуляцию с широко распространенной понижающей регуляцией, так что общий уровень транскрипта сохраняется. Эти находки повышают вероятность того, что формирование паттерна фолликулов контролируется ограничением способности отвечать на Eda, при этом возникающие фолликулы блокируют экспрессию Edar и, следовательно, судьбу фолликулов в своем окружении.

Модуляция реакции Eda в развивающейся коже. ( A ) Выражение Edar в E12 WT, E14 WT и E14 Edaradd ^{– / –} мутантная кожа и полуколичественный анализ интенсивности сигнала Edar вдоль красной линии. (Масштаб: 100 мкм.) ( B ) Edar Уровни экспрессии в коже из Edaradd ^{– / –} и Эдарад ^+/- эмбрионов, нормализовано до Keratin14 . ( C ) Выражение Shh в WT и Eda ^{– / –} культур кожи, обработанных рекомбинантным белком Eda. Eda ^{– / – Кожа} демонстрирует краевой эффект с фокусами, выражающими Shh , выровненными по краю эксплантата ( нижний центр ).Высокие концентрации Eda вызывают образование полос на мутантной коже (наконечник стрелки). Каждая панель показывает 1 мм ² . ( D ) Плотность волосяных фолликулов, индуцированная рекомбинантным Eda в E14 WT и Eda ^{– / –} скин. Планки погрешностей показывают SEM. ( E и F ) Время формирования паттерна и морфогенетических событий. ( E ) Edar выражение в E14 Eda ^{– / –} кожных культур после введения 50 нг / мл Eda.Каждая панель показывает 1 мм ² . ( F ) Секционные Eda ^{– / –} кожа после введения Эды. Первым морфологическим признаком образования волосяного фолликула является конденсация клеток с образованием плакод (стрелки). (Масштаб: 25 мкм.)

Если ограничение Edar фолликулами и его подавление в окружающих их клетках являются ключевыми событиями в формировании паттерна, тогда кожа WT, которая уже содержит зачатки фолликулов, должна быть менее компетентной, чем мутантная кожа Eda для образования фолликулов в ответ на экзогенные Еда.Мы культивировали WT и Eda ^{– / –} Дорсальная кожа E14 в различных концентрациях рекомбинантного Eda и оценка плотности волосяных фолликулов путем обнаружения Shh (sonic hedgehog), раннего маркера волосяных фолликулов (18). Кожа WT содержит ≈30 фолликулов на квадратный миллиметр в отсутствие экзогенного Eda, увеличиваясь до 50 фолликулов на квадратный миллиметр при высоких концентрациях Eda. Eda ^{– / –} Кожа намного более восприимчива к Eda, генерируя максимум 90 фолликулов на квадратный миллиметр (рис.1 C и D ). При высоких концентрациях Eda мутантная кожа генерировала полосообразные узоры, которые никогда не наблюдались у WT (рис. 1). С ). Образование полос предсказывается в системах активации-ингибирования, когда концентрации активатора становятся насыщающими (19).

Мы заметили, что обработанные мутантные, но не WT, эксплантаты имели зачатки фолликулов, выровненные по их краям (рис. С ). Это наблюдение можно было бы объяснить, если бы клетки по краю ткани имели преимущество в формировании фолликула за счет освобождения от ингибирующих факторов клеток с одной стороны.Это краевой эффект и то, что Eda ^{– / –} Кожа может генерировать почти в два раза больше фолликулов, чем WT, утверждает, что конечное расположение фолликулов не предопределено у мутантов Eda . Эти результаты предполагают, что применение экзогенного Eda в этой культуральной системе инициирует формирование паттерна, а не просто обнаруживает ранее существовавший, загадочный паттерн. Взятые вместе, эти результаты связывают широко распространенную экспрессию Edar с широко распространенной способностью формировать волосяной фолликул и указывают на то, что существующие фолликулы вызывают ограничение этого потенциала развития.

Время формирования паттернов и морфогенетических событий.

Для изучения скорости формирования паттерна и морфогенеза фолликулов мы культивировали Eda ^{– / –} скин с Eda и фиксированные образцы в разные моменты времени. Мы обнаружили упорядоченный образец очагов, выражающих Edar , появляющихся через ≈10 часов после введения Eda, после чего пятна рассасывались и усиливались до 24 часов (рис. E ).Первый окончательный морфологический признак образования фолликулов, образование конденсированной плакоды, стал видимым только через 20 часов после нанесения Eda (рис. F ). Таким образом, в этой системе молекулярный препаттерн предшествует появлению морфологически идентифицируемых плакод на ≈10 ч.

Eda незаменим для формирования узоров.

Трансгенная линия OVE951 несет большое количество копий искусственной хромосомы дрожжей, которая включает весь локус Edar (20) и, следовательно, сверхэкспрессирует Edar в своем эндогенном паттерне (10).Мы количественно оценили экспрессию Edar в трансгенной коже на ст. E14, обнаружив, что она в 4 раза выше, чем в нетрансгенной коже (рис. А ). Мы обнаружили, что введение этого локуса, сверхэкспрессирующего Edar , в локус Eda ^{– / –} линия приводит к восстановлению образования первичных фолликулов, что определяется экспрессией Shh (рис. B – D ). Это открытие показывает, что умеренная сверхэкспрессия Edar приводит к передаче сигналов, не зависящей от лиганда, и иллюстрирует, что точный паттерн фолликулов может быть сформирован в отсутствие Eda.

Eda незаменима для формирования узоров. ( A ) Определение qPCR экспрессии Edar в E14 Edaradd ^{– / –} нетрансгенный (NT) и Edaradd ^{– / –} скин OVE951. ( B- – D ) In situ обнаружение Shh в WT ( B ), Eda ^{– / Y} ( C ) и Eda ^{– / Y} ( D ) Эмбрионы OVE951 E15.Экспрессия обнаруживается только в вибриссах мутанта, но сверхэкспрессия Edar спасает мутантный фенотип, создавая точный паттерн фолликулов.

Сигнализация BMP запрещает выражение

Обнаружение того, что экспрессия Edar не обнаруживается в клетках, близких к формирующимся фолликулам, тогда как более отдаленные клетки экспрессируют умеренные уровни Edar , предполагает, что ранние волосяные фолликулы продуцируют диффузный ингибитор экспрессии Edar , который ограничивает способность предполагать эту судьбу в окружающих клетках.Два секретируемых лиганда были описаны как ингибиторы образования фолликулов: BMP (21, 22) и EGF (23). Обе эти молекулы блокируют опосредованное Eda образование фолликулов в культуре (рис. 3). A ), и поэтому оба являются кандидатами на роль Edar – подавляющее действие. Мы протестировали эти молекулы на ингибирование экспрессии Edar в культурах кожи эмбрионов. Важно, что ингибитор Edar должен действовать до принятия решения о судьбе фолликула, и поэтому он должен репрессировать базальную экспрессию Edar , наблюдаемую до формирования паттерна.Повышенная регуляция экспрессии Edar, наблюдаемая в зачатках фолликулов, может находиться под определенным регуляторным контролем. Поскольку мутантная кожа демонстрирует только широко распространенную умеренную экспрессию Edar (рис. A ), мы использовали его для этих экспериментов. Мы обнаружили, что BMP сильно подавляли экспрессию Edar , тогда как EGF этого не делал (рис. В ). Репрессия BMP Edar происходит быстро и коррелирует с уровнями фосфо-Smad1 / 5/8, активированной формы внутриклеточных преобразователей сигналов BMP (рис.3 С ).

BMP подавляют экспрессию Edar . ( A ) BMP4 и EGF ингибируют образование фолликулов, индуцированное в Eda ^{– / –} скин от Eda. ( B ) Количественное определение экспрессии Edar в E13 Edaradd ^{– / –} Кожа, обработанная в течение 24 часов BMP или EGF.( C ) Динамическое ингибирование Edar BMP4 и соответствующие уровни фосфо-Smad. ( D ) Shh выражение в Eda ^{– / –} кожа, обработанная только Noggin, только Eda или Eda plus Noggin в течение 24 часов. ( E ) Плотность волосяных фолликулов в Eda ^{– / –} Кожа, обработанная Eda с Noggin или без него в течение 24 часов. Планки погрешностей показывают SEM.

Чтобы определить, влияют ли эндогенные BMP на формирование паттерна, мы использовали Noggin, специфический ингибитор BMP 2, 4 и 7 (24).Максимальная плотность волосяных фолликулов, достигаемая с помощью обработки Eda Eda ^{– / –} скин составлял ≈90 на квадратный миллиметр (рис. D ). Совместное лечение препаратом Noggin нарушило этот предел, позволив сформировать 140 фолликулов на квадратный миллиметр (рис. 3). D и E ), без образования полос. Этот результат демонстрирует, что эндогенные BMP ограничивают реакцию Eda во время формирования паттерна. Обработка одним только Noggin вызвала образование небольших скоплений фолликулов в мутантной коже, что указывает на то, что ослабления передачи сигналов BMP достаточно, чтобы позволить спорадическое образование фолликулов в отсутствие активности Edar (рис.3 D ).

BMP действуют на расстоянии от фолликула.

Поскольку сам фолликул продуцирует BMP (25) и имеет высокую экспрессию Edar , он должен использовать механизм, позволяющий уклоняться от понижающей регуляции Edar , управляемой BMP. Мы обнаружили, что фактор роста соединительной ткани (CTGF), который связывается с BMP и ингибирует их аналогично Noggin (26), экспрессируется в плакодах волосяных фолликулов (рис. 4). A ) и является быстро активируемой мишенью передачи сигналов Edar (рис.4 В ). В отличие от CTGF , другие ингибиторы передачи сигналов BMP, экспрессируемые в развивающейся коже [ Noggin , Smad7 и Sostdc1 (склеростиновый домен 1) / Ectodin / WISE (25, 27)] сами являются транскрипционными мишенями BMP (рис. 4). C ), вероятно, действуя как ингибиторы обратной связи сигнального пути. В соответствии с идеей о том, что плакода является зоной с приоритетом BMP, мишень BMP Sostdc1 экспрессируется вокруг и вдали от фолликулярных источников BMP, но не внутри них (рис.4 D ), а фосфо-Smad1 / 5/8 обнаруживается в межфолликулярном эпидермисе E15, но в основном отсутствует в формирующихся фолликулах (рис. E ). Совместная обработка культур кожи с Eda и BMP подавляет индукцию BMP его целевого гена Smad7 , с этим ослаблением транскрипционных ответов BMP, сопровождаемым подавлением фосфорилирования Smad (рис. F ). Способность Eda подавлять ответы BMP зависит от активации NF-κB, потому что фармакологическое подавление этого фактора транскрипции обеспечивает полный ответ BMP в присутствии Eda (рис.4 G и H ). Это открытие согласуется с ролью генов-мишеней Eda в ингибировании BMP, а не с каким-либо прямым вмешательством между компонентами путей передачи сигналов Eda и BMP. Таким образом, BMP действуют на расстоянии от места их синтеза, а сам ранний фолликул устойчив к их действию. Взятые вместе, эти эксперименты показывают, что BMPs проявляют характеристики тормозного плеча петли активации-ингибирования.

BMP действуют на расстоянии от формирующегося фолликула. ( A ) CTGF экспрессируется в зачатках волосяных фолликулов в E15 WT, но не Eda ^{– / –} , эмбрионы. Выражение также заметно на веках. (Масштаб: 1 мм.) ( B ) Количественное определение мРНК CTGF в отделенном эпидермисе и дерме мутантной кожи, обработанной 1000 нг / мл Eda в течение 4 часов. Стимуляция Edar индуцирует экспрессию CTGF в эпидермисе, при этом наблюдается небольшая дермальная экспрессия.( C ) Количественное определение экспрессии гена в эпидермисе через 5 часов после добавления BMP4 ко всей коже. Noggin , Smad7 и Sostdc1 индуцируются обработкой BMP, тогда как CTGF – нет. ( D ) Sostdc1 экспрессируется вокруг зачатков фолликулов и вдали от них через 24 часа после введения Eda. (Масштаб: 100 мкм.) ( E ) Иммунодетекция фосфо-Smad1 / 5/8 в эпидермисе кожи E15 WT с низкими уровнями в плакодах фолликула (стрелка).(Масштаб: 100 мкм.) ( F ) Экспрессия Smad7 в эпидермисе через 5 часов после нанесения BMP4 с нанесением Eda или без него и соответствующими уровнями фосфорилирования Smad1 / 5/8 в эпидермисе. Совместное лечение с Eda подавляет вызванную BMP активацию Smad7, и фосфорилирование Smad1 / 5/8. ( G ) Экспрессия Smad7 в изолированном эпидермисе через 5 часов после BMP4 с применением или без применения Eda в присутствии ингибитора NF-κB BAY 11-7082. ( H ) Bay 11-7082 блокирует опосредованное Eda фосфорилирование IκBα в эпидермисе.Планки погрешностей показывают SEM.

Транскрипционные ответы на передачу сигналов Эдара.

Если Edar функционирует в плече активации этой петли, то он должен быть способен повышать свою собственную экспрессию, а также экспрессию BMP s. Для идентификации сигнальных мишеней Edar мы обработали Eda ^{– / –} культур с Eda и проанализировали экспрессию генов в изолированном эпидермисе и дерме.Мы использовали высокую дозу Eda для достижения грубой регуляции экспрессии целевого гена, а не для перемещения экспрессии, наблюдаемого во время процесса формирования физиологического паттерна. Edar Экспрессия умеренно активировалась Eda в течение 4 часов с подавлением передачи сигналов BMP при одновременном лечении с Noggin, усиливающим эту ауторегуляцию (рис. 5). А ). Анализ экспрессии BMP через 4 и 10 часов не обнаружил значительных изменений в уровнях BMP2 (данные не показаны), тогда как BMP4 сильно активировался в дерме через 10 часов (рис.5 В ). BMP7 показал наиболее быструю реакцию на Eda с первоначально низкими уровнями в дерме, которые активируются в течение 4 часов (рис. A ) и сильно повышается через 10 ч (рис. 5). В ). Eda-индуцированные BMP s были локально экспрессированы (фиг. 5). В ). Поскольку экспрессия Edar ограничена эпидермисом (рис. 5) A ), дермальная активация BMP4 и BMP7 должна быть косвенным эффектом.Интересно, что помимо увеличения общих уровней BMP, предполагается, что повышающая регуляция BMP7 в дермальном компартменте сделает возможным образование гетеродимеров BMP4 / 7, которые, как было показано, являются гораздо более мощными сигналами, чем гомодимеры BMP (28).

Время транскрипционных событий, модель формирования паттерна и гиперактивация Эдара.( A ) Eda ^{– / – Мутантные эксплантаты} культивировали с Eda или без него с Noggin или без него в течение 4 часов, а экспрессию Edar , BMP4 и BMP7 определяли в отдельных эпидермисе и дерме. ( B ) Уровни экспрессии и локализация BMP в мутантной коже, культивированной с Eda в течение 10 часов. Индуцированная экспрессия BMP4 и BMP7 пунктирована. ( C ) Предполагаемые молекулярные взаимодействия, которые генерируют структуру первичных волосяных фолликулов.Сплошные линии указывают на автономные для клеток локальные взаимодействия, а пунктирные линии указывают на действия на расстоянии. ( D ) Иммуноокрашенные кератином 14 продольные срезы и окрашенные гематоксилином и эозином поперечные срезы дорсальной кожи 10-дневных трансгенных и нетрансгенных однопометников K14 :: LMP1-Edar. ( E ) Количественное определение плотности волосяных фолликулов в коже спины трансгенных и нетрансгенных мышей. Планки погрешностей показывают SEM.

На основании этих результатов мы предлагаем модель формирования паттерна первичных волосяных фолликулов (рис.5 C ), в котором наивный эмбриональный эпидермис равномерно экспрессирует молекулы, которые активируют (Eda и Edar) и ингибируют (BMP) идентичность волосяных фолликулов. Эдар подвергается локальной ауторегуляции и усилению сигнала, индуцирует CTGF и косвенно регулирует экспрессию BMP в дерме. Локальное ингибирование передачи сигналов BMP заставляет их действие на расстоянии репрессировать эпидермальный Edar и, следовательно, судьбу фолликула. Эти взаимодействия служат для усиления отклонений в начальных условиях для создания пространственно организованного массива фолликулов.

Мы стремились включить β-catenin в эту модель, потому что его активация важна для формирования паттерна фолликулов и морфогенеза (29). Мы проанализировали экспрессию Axin2 , гена-мишени прямого β-катенина (30), и обнаружили упорядоченный массив Axin2 -положительных очагов в эпидермисе WT E15. Eda ^{– / –} кожа имела случайные кластеры из этих Axin2 фокусов, что указывает на то, что некоторая точечная активность β-catenin присутствует в отсутствие передачи сигналов Edar.В культуре эти очаги подавлялись BMP и усиливались или стабилизировались Eda. Таким образом, некоторая предварительно запатентованная активность β-catenin оказывается независимой от функции Edar. Это наблюдение явно противоречит нашей модели, в которой функция Эдара регулирует решения о формировании паттернов. Одна возможность состоит в том, что эти фокусы Axin2 являются предполагаемыми местоположениями фолликулов, которые потенциально могут быть стабилизированы Эдаром. Чтобы определить, когда окончательный рисунок фолликулов станет фиксированным, мы разрезали культивированную кожу в разное время после применения Eda и искали выравнивание фолликулов по вновь сгенерированному краю.Краевые эффекты наблюдались, когда кожа подвергалась воздействию Eda в течение <10 ч, тогда как по истечении этого времени способность рисунка к изменению конфигурации в ответ на возмущение поля теряется (эти данные представлены на рис.6, который опубликован как вспомогательная информация на веб-сайте PNAS). Эти находки указывают на то, что лабильный препаттерн существует в отсутствие передачи сигналов Edar, но что требуется> 10 часов молекулярного согласования в присутствии Eda, чтобы зафиксировать окончательный паттерн.

Предлагаемая модель рассматривает ограничение активности Edar как решающее событие в формировании паттерна.Следовательно, он делает предсказание, что широко распространенная активация Edar должна привести к широко распространенному предположению о судьбе волосяного фолликула. Мы создали трансгенных мышей, экспрессирующих кДНК, состоящую из внутриклеточного домена Edar, слитого с трансмембранными доменами LMP1, вирусного белка, который передает лиганд-независимую передачу сигналов при слиянии с рецепторами на клеточной поверхности (31). Эта кДНК экспрессировалась в базальном слое эпидермиса с использованием промотора Keratin14. Три независимых мыши-основателя показали утолщенную чешуйчатую кожу, и из-за плохого состояния здоровья их пришлось убить в течение 20 дней после рождения.Разделение показало, что кожа этих животных была покрыта опущенными волосяными фолликулами, причем фолликулы плотно прилегали друг к другу, практически без промежутков между ними (рис. 5). D ). Количественное определение фолликулов в трансгенной коже спины показало, что она имеет плотность на ≈40% больше, чем у нетрансгенных однопометников (рис. E ). Это поколение сверхкомплектных фолликулов подтверждает важность ограничения передачи сигналов Edar в генерации соответственно структурированного массива волосяных фолликулов.

Обсуждение

Мы предлагаем управляемую рецептивностью модель образования волосяных фолликулов, в которой регуляция экспрессии Edar является ключевой. Другие системы активации-ингибирования, которые были изучены на молекулярном уровне, такие как определение разветвленной структуры пера (32) или лево-правой асимметрии позвоночных (33), полагаются на дифференциальные диффузионные свойства двух секретируемых лигандов. Напротив, модуляция реакции принимающей ячейки на широко доступный сигнал занимает центральное место в нашей модели.

Такие механизмы формирования паттерна основаны на разном диапазоне активирующих и ингибирующих молекул. Эдар и β-катенин ограничены клеткой, в которой они продуцируются, тогда как CTGF и BMP являются секретируемыми молекулами. Это свойство предполагает, что действие CTGF должно быть пространственно ограничено. Ограничение может быть достигнуто иммобилизацией CTGF на компонентах внеклеточного матрикса или диффузией комплексов CTGF-BMP с последующим высвобождением активных BMP. Наблюдение за тем, что мутантная и WT-эмбриональная кожа имеют одинаковые уровни экспрессии Edar (рис.1 B ) лучше всего объясняется тем фактом, что, хотя Eda активирует экспрессию Edar , он также индуцирует BMP s, которые подавляют Edar .

Используемый нами метод культивирования позволяет синхронизировать образование фолликулов и делает кожу доступной для экспериментальных манипуляций. Однако важно, чтобы наблюдения таких систем ex vivo коррелировали с результатами, полученными на интактных животных.В частности, применение рекомбинантных белков имитирует трансгенные подходы к усилению функции, тогда как эксперименты с потерей функции важны для понимания эндогенных функций. У целых животных устранение передачи сигналов Edar специфически блокирует образование первичных волосяных фолликулов (10), тогда как подавление активации β-катенина предотвращает образование всех типов фолликулов (29). В соответствии с ингибирующей ролью BMP в процессе формирования паттерна, делеция генов рецепторов BMP в эмбриональном эпидермисе вызывает увеличение плотности фолликулов к концу первичной волны образования фолликулов на E16 (34).Кроме того, делеция Noggin , предположительно приводящая к усилению передачи сигналов BMP, снижает количество волосяных фолликулов. Однако мутация Noggin специфически удаляет вторичные фолликулы, позволяя формироваться первичным фолликулам (14). Этот мутантный фенотип может указывать на то, что Noggin является основным ингибитором BMP, используемым вторичными фолликулами, чтобы избежать аутостимуляции BMP, в то время как первичные волосяные фолликулы вместо этого используют CTGF. Мыши CTGF -null демонстрируют аномалии скелета и умирают при рождении (35), но их кожный фенотип не описан.

В наших экспериментах манипулирование сигнальной активностью позволило модулировать плотности плакод в широком диапазоне, от 30 на квадратный миллиметр до 140 на квадратный миллиметр. Эта пластичность, а также выравнивание фолликулов вдоль границы рассеченных эксплантатов кожи указывает на то, что их конечные местоположения не были определены в мутантной коже Eda . Однако мы действительно обнаружили спорадическую экспрессию Axin2 , что свидетельствует о паттернированной активности β-катенина в отсутствие Eda.Эти очаги могут быть теми же клетками, которые были недавно идентифицированы как инициирующие, но неспособные поддерживать очень ранний морфогенез фолликулов в мутантной коже Edar (36). Податливость положения фолликула в ответ на экспериментальное возмущение предполагает, что этот препаттерн не обязательно представляет собой окончательный набор волосяных фолликулов. Axin2 -экспрессирующие очаги могут быть «предполагаемыми» местоположениями фолликулов, которые становятся фиксированными или иным образом, поскольку функция Edar ограничена в коже. Хотя взаимосвязь между β-catenin и Edar еще предстоит полностью выяснить, одной из связей между этими сигнальными модулями является обнаружение того, что BMP ингибирует образование фокусов Axin2 , тогда как Edar подавляет ответы BMP.Таким образом, Эдар может косвенно усиливать функцию β-катенина, защищая его от действия BMP. Плакоды, индуцированные Noggin в коже мутанта Eda (рис. D ) может представлять собой такую ​​стабилизацию Axin2 фокусов.

Повышающая регуляция Edar , наблюдаемая в ранних плакодах, вероятно, влияет на его сигнальные свойства, что иллюстрируется его сверхэкспрессией под контролем нативных регуляторных элементов в линии OVE951. Способность умеренно повышенных уровней рецепторов компенсировать дефицит Eda предполагает, что повышающая регуляция рецепторов обеспечивает передачу сигналов, не зависящую от лиганда.Таким образом, аутоактивация экспрессии Edar , которая обычно происходит в ранних плакодах, может быть достаточной, чтобы позволить Eda-независимую передачу сигнала, помогая установить приверженность судьбе фолликула. Наша модель предсказывает, что эктопические фолликулы в этом случае не образуются, несмотря на автономную передачу сигналов Edar, потому что его экспрессия остается чувствительной к ингибированию BMP. Линия K14: LMP1-Edar была сконструирована так, чтобы иметь независимую от лиганда передачу сигналов, но дала гораздо более драматический фенотип формирования эктопических фолликулов.Это наблюдение соответствует нашей модели, потому что экспрессия, управляющая промотором, не подвержена подавлению BMP. Кожа этой трансгенной линии по существу не имеет рисунка в том смысле, что фолликулы просто заполняют все доступное пространство, а не пространственно регулируют свое расположение. Фенотип, индуцированный Эдаром, контрастирует с эффектами широко распространенной трансгенной активации β-катенина, которая вызывает рост новых фолликулов только в коже взрослых мышей, но не приводит к образованию эктопических фолликулов в эмбриональном периоде (37).Это открытие предполагает, что ограничение активации β-catenin не ограничивает определение местоположения волосяных плакод, хотя его активность явно необходима для образования фолликулов.

В этой работе мы обеспечиваем основу для построения других факторов, участвующих в развитии волосяных фолликулов, поскольку их отношения с путями Edar и BMP не раскрыты. В более широком смысле, вероятно, что вариации этой молекулярной сети лежат в основе формирования паттерна в развитии чешуек и перьев, а также в формировании морфологии зубов.Кроме того, наши находки эпидермально-дермальной коммуникации с самых ранних стадий формирования паттерна указывают на решающую роль обеих тканей и противоречат простому мнению, что позиционная информация сначала генерируется в дерме, а затем передается в пассивный эпидермис.

Методы

Животные.

WT, Eda ^{Ta / Ta} и Edaradd ^{cr / cr} строк находились на фоне FVB / N.Трансгенных животных OVE951 использовали для обнаружения Edar путем гибридизации in situ . Eda находится на Х-хромосоме; для краткости Eda ^{– / –} используется в тексте для обозначения женского пола Eda ^{– / –} и вилка Eda ^{– / Y} животных. Для спариваний по времени день, когда была обнаружена вагинальная пробка, засчитывался как день 0.K14: Трансгенных мышей LMP1-Edar получали, как описано (38).

Образцы фиксировали в 4% параформальдегиде в PBS в течение ночи при 4 ° C. Гибридизацию проводили, как описано (39). In situ гибридизации были сфотографированы, и плотность фолликулов была определена путем подсчета количества Shh -экспрессирующих фокусов в квадрате со стороной 1 мм. Для определения плотности каждого фолликула использовали данные по крайней мере трех независимых культур эксплантатов кожи.Края кожи в анализ не включались. Полоски учитывались как единый фолликул.

КПЦР.

подвергали обратной транскрипции с использованием случайных праймеров и обратной транскриптазы AMV (Roche) в реакционной смеси объемом 20 мкл. Реакции разбавляли в 10 раз, и 5 мкл использовали в качестве матрицы для каждой количественной ПЦР. Зонды TaqMan были предоставлены Applied Biosystems. Использовались следующие зонды: β Актин (4352341E), BMP2 (Mm01962382_s1), BMP4 (Mm00432087_m1), BMP7 (Mm00432102_m1), 902 (Mm00432102_m1), 902_m1 Keratin14 (Mm00516876_m1), Noggin (Mm00476456_s1), Smad7 (Mm00484741_m1) и Sostdc1 (Mm00840254_m1).Двадцать микролитровых реакций проводили в трех экземплярах с использованием термоциклера OpticonII, используя по меньшей мере три биологических повтора для определения каждой точки данных. Мы не наблюдали изменений в общем количестве экспрессии β актина при различных экспериментальных обработках. Для каждого эксперимента контрольные и обработанные образцы были из одного помета. Относительные или абсолютные количества нормализатора и тестовых транскриптов рассчитывали по стандартной кривой.

Культура и лечение органов кожи.

Кожу на спине иссекали, помещали на фильтр MF-Millipore на металлической сетке и погружали в DMEM плюс 5% FBS в чашке с центральными лунками (Falcon) при 37 ° C и 5% CO. ₂ . Эпидермально-кожное разделение проводили путем инкубации образцов кожи при 37 ° C в течение 10 минут с диспазой 2 мг / мл (GIBCO). Ткани гомогенизировали в реагенте TRI (Sigma) для выделения общей РНК и белков. Рекомбинантный EdaA1 (17) использовали в концентрации 50 нг / мл для in situ, гибридизации и гистологии и в концентрации 1000 нг / мл для анализа транскрипционных мишеней с помощью кПЦР.Рекомбинантные BMP и EGF использовали в концентрации 500 нг / мл, а Noggin использовали в концентрации 1000 нг / мл. BMP2 человека, BMP4 человека, BMP7 человека, EGF мыши и белки Noggin мыши были получены от R&D Systems. Для экспериментов с одновременной обработкой Noggin культуры предварительно обрабатывали Noggin в течение 2 часов перед добавлением Eda. BAY 11-7082 (Calbiochem) использовали в концентрации 20 мкМ.

Гистология и иммуногистохимия.

Образцы фиксировали в 4% параформальдегиде в PBS при 4 ° C в течение ночи, а затем обезвоживали и заливали парафином.Шестиметровые срезы окрашивали гематоксилином и эозином, 1/1000 FITC-конъюгированным анти-Keratin14 (Covance) или 1/100 кроличьим анти-фосфо-Smad1 / 5/8 (Cell Signaling Technology). Первичные кроличьи антитела детектировали с использованием 1/200 биотинилированных козьих антител против кроликов (Upstate Biotechnology) и пероксидазы ABC (Vector Laboratories).

Вестерн-блоттинг.

Пробы белка обрабатывали на 12% SDS / полиакриламидном геле и переносили на нитроцеллюлозную мембрану.Блоты блокировали в 5% обезжиренном молоке в TBS / 0,1% Tween 20 в течение 1 часа, а затем зондировали первичными антителами [1/25000 мышиных моноклональных анти-β Actin -пероксидазы конского редиса AC-15 (Sigma), 1/1 000 антибиотиков. -фосфо-Smad1 / 5/8 и 1/2 000 мышиных анти-фосфо-IκBα 5A5 (технология передачи сигналов клеток)] в TBS / 0,1% Tween 20 в течение ночи. Сигнал детектировали с использованием вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена, и хемилюминесцентного субстрата.

Благодарности

Благодарим С.M. Chuong, M. Dixon, D. Garrod, E. Harris, A. Hurlstone, H. Meinhardt, C. Thompson и R. Widelitz. Работа поддержана грантом Wellcome Trust Grant 075220 / Z.

Сноски

• ^§ Кому следует направлять корреспонденцию. Эл. адрес: denis.headon {at} manchester.ac.uk

• Вклад авторов: C.M., P.S., P.A.O. и D.J.H. спланированное исследование; К.М., Б.Дж. и Д.J.H. проведенное исследование; P.S. внесены новые реагенты / аналитические инструменты; СМ. и Д.Дж. проанализированные данные; и К. и Д.Дж. написал газету.

• Заявление о конфликте интересов: о конфликте интересов не сообщалось.

• Этот документ был отправлен напрямую (Трек II) в офис PNAS.

• Сокращения:

  Сокращения:

  BMP,

  костный морфогенетический белок;

  CTGF,

  фактор роста соединительной ткани;

  Eda,

  эктодисплазин;

  ,

  Edar,

  ,

  рецептор Eda;

  Эдарад,

  Эдар-связанный домен смерти;

  кПЦР,

  количественная ОТ-ПЦР;

  En,

  эмбриональный день n.

• © 2006 Национальная академия наук США

Как хронический стресс приводит к выпадению волос