Стрижка жгутиками: Мой опыт стрижки жгутиками. 5 советов тем, кто собирается на стрижку

Аксонемы дикого типа (WT), штаммы cpc1-1 и нокдаун Klp1-RNAi (AC92) были подвергнуты блоттингу с различными антителами (метки слева) для выявления уровень специфических белков центральной пары. Hydin несколько снижен в аксонемах мутанта cpc1-1 , как описано ранее [Lechtreck and Witman, 2007], и полностью отсутствует в аксонемах штамма AC92, нокдаун Klp1.О влиянии нокдауна Klp1 на Hydin ранее не сообщалось, хотя он согласуется с потерей проекции 2b у этого штамма [Yokoyama et. др., 2004]. Klp1 не затрагивается в аксонемах от мутанта cpc1-1 и снижен в штамме нокдауна. Промежуточная цепь динеина внешнего ряда IC2 использовали в качестве контроля загрузки.

Мост CPC представляет собой сложный набор соединений между C1 и C2

MT C1 и C2 CPC были описаны как связанные набором из трех структур: двухчастного моста и диагональной связи, которые вместе , известны как мосты с периодичностью 16 нм вдоль продольной оси аксонемы () [Warner, 1976; Linck et al., 1981; Митчелл, 2003а; Nicastro et al., 2005]. Наши знания о белковом составе моста ограничены. Только PF20 однозначно локализован на мостике и считается важным для стабильной сборки CPC, поскольку мутантные аксонемы pf20 и обладают фенотипом 9 + 0, то есть им не хватает всего CPC [Smith and Lefebvre, 1996, 1997] . pf16 аксонемеш имеют фенотип 9 + 1 с нестабильным C1 MT, а PF16 также может локализоваться в мостике [Zhang et al., 2005].Наши крио-ET данные CPC от Chlamydomonas и Strongylocentrotus показывают, что мост на самом деле представляет собой сложную сеть соединений, которые связывают C1 и C2 MT () и которые также, кажется, создают несколько соединений с 1a, 1b, 2a и 2b проекции ().

Компоненты моста имеют одинаковую общую форму у Chlamydomonas и Strongylocentrotus , если смотреть в разрезе (). Однако в продольных срезах очевидно меньше сходства ().Интересно, что в Strongylocentrotus компоненты моста, по-видимому, ориентированы в основном перпендикулярно МТ, тогда как в Chlamydomonas диагональные компоненты поперечно связывают ступеньки моста (сравните). Возможно, что эта взаимосвязанная мостовая сеть придает большую структурную гибкость вращающемуся CPC Chlamydomonas . Если так, это могло бы позволить небольшие изменения в относительных положениях между C1 и C2, что могло бы объяснить, почему локальное выравнивание, сфокусированное на отдельных CPC MT, улучшило их разрешение по сравнению с глобальным выравниванием (вспомогательная информация, рис.S1A и S1B). Учитывая огромную сложность моста, который мы наблюдали, возможно, что мост не только является фиксированной структурой, связывающей оба CPC MT, но также может иметь биохимическую функцию, например передача сигналов между проекциями C1 и C2 и, в конечном итоге, головкам RS и динеинам. Изучение белкового состава моста поможет понять его роль в моторике аксонемы.

MIP могут обеспечивать стабильность C2 MT во вращающемся CPC

MIP представляют собой белки, прикрепленные к внутренней стенке MT и впервые были описаны во внешних DMT аксонем Chlamydomonas [Nicastro et al., 2006]. В этом исследовании мы идентифицировали два новых MIP в C2 MT из Chlamydomonas CPC. Насколько нам известно, это первое описание MIP в MT CPC. MIP-C2a составляет ~ 50 кДа и повторяется каждые 16 нм, тогда как MIP-C2b составляет ~ 35 кДа и повторяется каждые 8 ​​нм (и). Две MIP находятся в непосредственной близости друг от друга и расположены на внутренней стороне C2 MT, которая обращена к мосту и C1 MT (,). Во внешних DMT, MIP, по-видимому, представляют собой высококонсервативные аксонемные структуры, обнаруженные у эволюционно далеких организмов [Nicastro et al., 2006, 2011; Пигино и др., 2012]. Белки, образующие MIP, а также их функции в настоящее время неизвестны, однако некоторые данные предполагают, что MIP могут вносить вклад в стабильность MT, поскольку термически обработанные DMT в Chlamydomonas сопротивляются деполимеризации на протофиламентах, к которым прикреплены MIP [Nicastro et al., 2006 ]. Mitchell и Smith [2009] наблюдали сравнимый феномен в CPC MTs не охарактеризованного мутанта Chlamydomonas , названного unc1 ; здесь единственная часть C2 MT, которая сопротивлялась деполимеризации, включала протофиламенты, которые связаны с мостиком.Наши данные показывают, что это одна и та же часть, содержащая MIP-C2a и MIP-C2b, поэтому возможная функция CPC MIP заключается в повышении стабильности MT на участке, который может испытывать высокие механические нагрузки.

Предыдущее исследование нашей лаборатории показало, что MIP1 в A-канальце Chlamydomonas DMT расположен внутри того же мономера тубулина, к которому также присоединен динеин I1, но на MT снаружи [Heuser et al. , 2012а]. Это предполагает, что MIPs могут также модулировать конформацию тубулина, чтобы генерировать специфические сайты прикрепления на MT снаружи.Точно так же местоположения CPC MIP, кажется, совпадают с частями моста, и возможно, что MIP играют роль в привязке частей моста к C2 MT. Помимо связывания C1 и C2 вместе, мосту не приписывается никакой другой роли, и поскольку до сих пор только один белок был локализован в мостике однозначно (PF20), надлежащий анализ его функции затруднен.

Мы не наблюдали МИП в ЦТК Strongylocentrotus . Следует отметить, что разрешение нашего среднего Strongylocentrotus было немного ниже, чем разрешение Chlamydomonas , вероятно, из-за меньшего количества усредненных томограмм и немного более толстых и, следовательно, более шумных криотомограмм жгутиков Strongylocentrotus , окруженных мембраной, по сравнению с жгутиками Strongylocentrotus , окруженными мембраной. разбавитель Хламидомонада аксонем.Хотя это маловероятно, мы не можем исключить возможность того, что с увеличением разрешения мы также обнаружим MIP, присутствующие в Strongylocentrotus . Сравнивая трехмерные структуры CPC Chlamydomonas и Strongylocentrotus с разрешением, указанным в этом исследовании, присутствие MIPs в водорослях и отсутствие MIPs у морского ежа было одним из немногих поразительных различий, которые мы обнаружили в высококонсервативных условиях. и удивительно похожая архитектура CPC у двух таких эволюционно далеких видов.Присутствие MIPs также в CPC дополнительно подчеркивает их важность и потребность узнать больше об их составе и функциональных ролях, которые они играют в сборке и / или подвижности ресничек и жгутиков.

Поразительная структурная консервация и высокая связность CPC подтверждают его роль в качестве главного сигнального узла, контролирующего подвижность ресничек

Большинство структурных и функциональных исследований CPC было проведено с использованием жгутиков Chlamydomonas . Из этих исследований мы узнали, что CPC является основным регулятором подвижности, и большинство мутаций CPC вызывают паралич жгутиков [Smith and Yang, 2004].Наши данные крио-ET демонстрируют поразительное структурное сходство между жгутиками одноклеточной водоросли Chlamydomonas и жгутиками сперматозоидов многоклеточного животного Strongylocentrotus , двух организмов, разделенных примерно 1 миллиардом лет эволюции (вспомогательный информационный фильм S3). Наши структурные данные показали, что общая архитектура CPC высоко консервативна среди видов, что согласуется с тем, что можно было ожидать от важного регулятора подвижности, и предполагает, что детальные регуляторные механизмы также могут быть сохранены.Результаты BLAST для большинства белков СРС Chlamydomonas показали высокую консервативность с белками аксонем человека [Mitchell, 2009; O’Toole et al., 2012]. Возможно, наиболее известным примером этой консервации является белок Hydin, который был локализован в проекции 2b у Chlamydomonas [Lechtreck and Witman, 2007] и мышей [Lechtreck et al., 2008]. Отсутствие Hydin в обоих организмах приводит к нарушению подвижности жгутиков / ресничек, демонстрируя замечательную консервацию структуры и функции этого белка от простейших до млекопитающих.

По нашим данным, мы наблюдали высокую степень связи между проекциями CPC и между MTs, что согласуется с гипотезой о роли CPC в качестве главного механохимического узла передачи сигналов, который контролирует подвижность ресничек и жгутиков. Связи между выступами встречаются как у Chlamydomonas , так и у Strongylocentrotus , хотя продольные связи вдоль оси MT более распространены у Chlamydomonas (), что может быть связано с более высоким механическим напряжением, испытываемым вращающимся CPC.Визуализация CPC в 3D с более высоким разрешением предоставила новые, ключевые идеи для корреляции структуры и функции этого важного регулирующего комплекса. Это также важный шаг к долгосрочной цели понимания того, как работают реснички и жгутики и как они не помогают при болезни.

Криоэлектронная томография подвижных ресничек и жгутиков | Реснички

Координация ресничек и жгутиков эукариот | Очерки биохимии

Основной отличительной чертой живых организмов является их способность генерировать и координировать движения. Даже растения, которые часто считаются статичными, демонстрируют целенаправленное, направленное движение для оптимизации роста (например,грамм. циркумнутация) [1]. На протяжении эволюции возникло множество расходящихся стратегий передвижения на суше, в воздухе и на море, включая плавание, ползание, галопирование и полет. Безусловно, самым древним из них является передвижение в жидкой среде (известное как подвижность), которое дало подвижным организмам возможность перемещаться к благоприятным условиям (свет, питательные вещества) и, следовательно, значительное селективное преимущество перед их неподвижными аналогами. Здесь мы сосредотачиваемся на подвижности, связанной с прикрепленными к поверхности придатками, известными как реснички или, взаимозаменяемо жгутиков .Эта повсеместная и эволюционно успешная органелла присутствует практически во всех существующих ветвях эукариот [2]. Рисунок 1 иллюстрирует ряд различных видов, охватывающих несколько порядков величины, которые неизменно используют реснички, чтобы плавать или перемещать жидкость из одной области в другую. В крайнем случае одноклеточные сперматозоиды распространяют изгибные волны от основания до кончика, чтобы протолкнуть себя через жидкость [3], двуцветная зеленая водоросль Chlamydomonas координирует два жгутика в синхронном брассе [4–6], в то время как более крупные инфузории, включая Paramecium и Stentor покрыты ресничками, которые стали специализированными либо для эффективного плавания, либо для кормления [7].В желудочках мозга реснички создают сложную направленную транспортную сеть для точного контроля перераспределения веществ [8] и даже обеспечивают структурную поддержку [9], в то время как в трахее человека скоординированное движение ресничек очищает от мусора и слизи и поднимает их вверх. из легких на расстояния в десятки сантиметров [10,11]. Опираются ли эти разнообразные цилиарные системы на единые механистические принципы для достижения скоординированных паттернов активности?

Маркировка белков раскрывает новые возможности передачи сигналов в жгутиках | Журнал клеточной биологии

В этом выпуске Oda et al.(2014. J. Cell Biol. http://dx.doi.org/10.1083/jcb.201312014) использовать мутантный анализ, маркировку белков и криоэлектронную томографию для определения подробного расположения компонентов в радиальных спицах жгутиков – сложном белков, которые соединяют дублеты периферических микротрубочек с центральной парой. Примечательно, что этот подход выявил взаимодействие между радиальными спицами и центральной парой, основанное на геометрии, а не на конкретном сигнальном механизме, подчеркивая важность изучения системы в трех измерениях.

Эукариотические жгутики и подвижные реснички представляют собой выступающие органеллы, которые обеспечивают подвижность клеток или генерируют поток внеклеточной жидкости. Эта органелла, состоящая из более чем 600 белков (Pazour et al., 2005), сохраняет такие функции, как изгиб и переключение волновых форм ионами кальция даже после выделения из тела клетки, указывая тем самым, что жгутики и реснички могут функционировать как замкнутая система. Понимание этой сильно разобщенной системы по своей сути интересно из-за поразительной организации и структуры этой органеллы, а также из-за ее медицинской значимости; дефекты этой органеллы ответственны за группу заболеваний, называемых цилиопатиями (Fliegauf et al., 2007). В этом выпуске Oda et al. представляют трехмерное расположение субнабора белков жгутиков / ресничек и обеспечивают понимание механической передачи сигналов в этой органелле.

Большинство жгутиков и подвижных ресничек имеют общую структуру аксонемы 9 + 2 (Fig. 1 A) с девятью дублетами микротрубочек, окруженными двумя синглетными микротрубочками (называемыми центральным парным аппаратом; Fig. 1 A, светло-зелеными). Соседние дублеты связаны изоформами основанного на микротрубочках моторного белка динеина.Дублеты периферических микротрубочек и центральная пара связаны комплексами из 23 белков (Yang et al., 2006), называемых радиальными спицами. Эти структуры образуют красиво упорядоченный массив вдоль дублетов микротрубочек с периодичностью 96 нм. Каждая радиальная спица имеет Т-образную структуру с псевдодвойной симметрией (Pigino et al., 2011; Barber et al., 2012). Радиальные спицы и центральная пара важны для поведения формы волны ресничек / жгутиков, регулируя генерацию силы динеина.

Несомненно, достоверное изучение индивидуальных белков важно для понимания механизма изгиба жгутиков / ресничек.Действительно, структурная биология динеина с высоким разрешением (Burgess et al., 2003; Kon et al., 2012; Roberts et al., 2012; Schmidt et al., 2012) позволила понять механизм генерации силы внутри жгутиков / ресничек. . Однако нам также необходимо изучить, как отдельные части интегрируются во всю систему. Мы должны прояснить, как отдельные компоненты взаимодействуют друг с другом, чтобы организовать высокоорганизованное изгибающее движение. Эта системная биология требует трехмерного картирования белков in vivo.

До сих пор расположение компонентных белков в жгутиках / ресничках в основном определялось путем сравнения структуры различных делеционных мутантов зеленых водорослей Chlamydomonas reinhardtii с использованием методов криоэлектронной томографии и усреднения субтомограмм. С помощью этого подхода было определено местонахождение всех основных видов динеина (Bui et al., 2008, 2012). Молекулярное расположение радиальной спицы менее определено.Пять белков из 23 локализованы в верхней части (называемой головным субдоменом; рис. 1А, вставка) этого Т-образного комплекса, рядом с аппаратом центральной пары. Остальные белки принадлежат субдоменам шейки и ножки. Генетическое истощение одного белка головки радиальной спицы (RSP4) вызывает потерю всей головки, вероятно, потому, что он необходим для сборки головки радиальной спицы. Хотя предыдущее исследование с использованием мутантов (Pigino et al., 2011) идентифицировало белки с радиальными спицами как группу, точное положение отдельных белков не было выяснено.Oda et al. (2014) позволили выполнить более подробное назначение путем создания мутантных штаммов. Когда RSP4 экспрессируется в штамме C. reinhardtii pf1, в котором отсутствует ген RSP4 и, следовательно, вся головка лучевой спицы, восстанавливается весь домен головки. Авторы экспрессировали RSP4, меченный белком-носителем карбоксила биотина (BCCP). Плотность метки BCCP появляется в криоэлектронной томографии, указывая положение RSP4 (рис. 1 B). Этот подход позволил не только выяснить местоположение белков, но также предоставил информацию об ориентации белков, насколько позволяет разрешение.Авторам удалось идентифицировать расположение N- и C-концов RSP4. Они также применили эту технологию к дополнительным белкам с радиальными спицами и показали, как две копии этого комплекса белков расположены в одном головном домене, что может поддерживать модель предварительной сборки, предложенную Diener et al. (2011).

Авторы вышли далеко за рамки простого структурного анализа. Вместо BCCP они метили белки разных размеров.Когда в качестве метки использовались относительно небольшие пептиды (BSA или His tag), подвижность жгутиков оказалась относительно нормальной. Однако прикрепление большого белка (стрептавидина) к С-концам RSP 3, 4 и 6, которые, согласно их структурному анализу, подвергаются взаимодействию с поверхностью раздела аппарата центральной пары, вызвало паралич. Напротив, экспрессия большой белковой метки, связанной с белком радиальной спицы, спасает подвижность парализованных мутантов, у которых отсутствуют белки, выходящие из центральной пары.Это замечательное открытие предполагает взаимодействие между аппаратом центральной пары и радиальной спицей, которое зависит от геометрии, которая, вероятно, модулирует механическое взаимодействие путем столкновения, а не вызывает конкретный механизм передачи сигнала. Механическое взаимодействие было предложено ранее в качестве гипотезы, основанной на геометрической взаимосвязи между радиальной спицей и центральной парой (Warner and Satir, 1974; Lindemann, 2003), отсутствии мотивов передачи сигнала в области головки радиальной спицы (Pigino и Ishikawa, 2012), и тот факт, что центральная пара скручивается в аксонеме (Mitchell and Nakatsugawa, 2004), это указывает на то, что граница раздела с радиальными спицами не является регулярной вдоль аппарата центральной пары.Oda et al. (2014) предоставляют первое экспериментальное подтверждение этой модели. Этот механизм сигнализации и их методология могут быть применимы к другим сценариям в соте.

Эта задача по картированию белков жгутиков / ресничек in vivo потребует дальнейшего развития и, вероятно, еще одного прорыва. Помимо динеина и радиальной спицы, было обнаружено и / или функционально проанализировано только ограниченное количество компонентных белков, даже частично – регуляторный комплекс динеина (Heuser et al., 2009), промежуточной и легкой цепей динеина f внутреннего плеча (Heuser et al., 2012; Yamamoto et al., 2013) и промежуточной цепи динеина внешнего плеча (Oda and Kikkawa, 2013). Более 500 белков из 600, перечисленных как компоненты жгутиков / ресничек, все еще нераспределены, тогда как многие особенности на томограмме остаются неидентифицированными. Систематические подходы к маркировке или метке белков в этой органелле ждут разработки. К сожалению, о создании мутантов с использованием гомологичной рекомбинации в C. , reinhardtii еще не сообщалось.Нокдаун с помощью RNAi может быть многообещающим подходом для определения местонахождения белков-мишеней и анализа их функции (Dymek et al., 2011; Rompolas et al., 2013). Если в будущем объединить нокдаун и экспрессию мутантных белков, это позволит систематически генерировать мутанты. Исследование жгутиков / ресничек, которое использует преимущества периодичности и симметрии / псевдосимметрии аксонемы, приведет к структурному и функциональному анализу in vivo других клеточных органелл, который проложит путь к трехмерной системной биологии.

Четырехмерный анализ с помощью высокоскоростной голографической визуализации выявляет хиральную память жгутиков сперматозоидов

Abstract

Здесь высокоскоростная цифровая голографическая микроскопия (DHM) регистрирует формы волны жгутиков сперматозоидов и пути плавания в четырех измерениях (X, Z и t). Мы обнаруживаем, что отклонения жгутиков в Z-плоскость почти такие же большие, как огибающая жгутиковых волн, проецируемых на XY-плоскость. Эти отклонения в плоскости Z распространяются в виде волн вниз по жгутику за каждый цикл биений.DHM также отслеживает головки свободно плавающих сперматозоидов, а также динамику и хиральность вращения сперматозоидов вокруг их длинной оси. Мы обнаружили, что сперматозоиды мыши вращаются по часовой стрелке при максимальном положительном отклонении головки в Z-плоскости, а затем вращаются против часовой стрелки при последующем максимальном отклонении в отрицательной Z-плоскости. Эта переменная хиральность вращения указывает на то, что сперматозоиды обладают хиральной памятью. Выравнивание Прокруста траекторий траекторий для последовательностей циклов кувырка-противодействие показывает, что хиральность траектории всегда CW для ячеек, анализируемых в этом исследовании.У сперматозоидов человека и быка отсутствует различимая левая и правая поверхности, но DHM по-прежнему указывает на координацию отклонений в плоскости Z и событий качения. Мы предполагаем, что у сперматозоидов есть хиральная память, которая находится в гипотетической эластичной связке внутри жгутикового механизма, которая хранит часть крутящего момента, необходимого для вращения CW или CCW для повторного использования в следующем противовращении. Отдельные механизмы контролируют хиральность пути.

Образец цитирования: Muschol M, Wenders C, Wennemuth G (2018) Четырехмерный анализ с помощью высокоскоростной голографической визуализации показывает хиральную память жгутиков сперматозоидов.PLoS ONE 13 (6): e0199678. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0199678

Редактор: Wilfried A. Kues, Friedrich-Loeffler-Institute, GERMANY

Поступила: 28 февраля 2018 г .; Принята к печати: 12 июня 2018 г .; Опубликован: 28 июня 2018 г.

Авторские права: © 2018 Muschol et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в документе и вспомогательных информационных файлах.

Финансирование: Поддержка была предоставлена ​​Deutsche Forschungsgemeinschaft; WE 2344 / 9-1 по G.W. Мы также благодарим за поддержку Фонд публикаций открытого доступа Университета Дуйсбург-Эссен.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Оплодотворение, слияние сперматозоидов и яйцеклеток, является одновременно началом новой жизни и кульминацией комплексного отбора отдельных оплодотворяющих сперматозоидов из миллионов, доставляемых в эякуляте млекопитающих.Такой отбор создает сложные барьеры в женских репродуктивных путях, которым противопоставляется плавание сперматозоидов, которое позволяет небольшому количеству сперматозоидов достигать места оплодотворения [1–3], а обзоры см. В [4, 5]. Признание того факта, что для самостоятельного оплодотворения требуется подвижность сперматозоидов, побудило к большому количеству исследований поведения сперматозоидов в плавании [3, 6, 7], волновых форм жгутиков, которые им управляют [8–12], сигнальных путей, которые контролируют или модифицируют его [13–21]. , и архитектуры жгутика [22-25], которая накладывает границы на все вышеперечисленное.Здесь наше внимание сосредоточено на форме волны жгутиков и поведении сперматозоидов при плавании.

Последние достижения в области голографической визуализации позволили количественно изучить трехмерный характер плавательных путей сперматозоидов млекопитающих [26–28] и беспозвоночных [29]. Однако до сих пор нет исследований, сообщающих о голографической визуализации жгутика сперматозоидов и его динамики.

Теперь мы применяем высокоскоростную голографическую визуализацию для одновременного изучения формы волны жгутиков и путей движения сперматозоидов от мыши, быка и человека.Некоторые особенности результатов характерны для сперматозоидов из этих источников, но реконструированные последовательности изображений сперматозоидов мыши особенно информативны, поскольку они позволяют непосредственно наблюдать хиральность вращения сперматозоидов вокруг их длинной оси.

Результаты

DHM регистрирует жгутиковые формы волны свободного плавания и сперматозоидов привязанной мыши

Четко сфокусированные проекции в плоскости XY могут быть легко восстановлены из временных рядов сохраненных голографических изображений, собранных DHM [30].На рис. 1A (слева) показан трек центроида головы типичной свободно плавающей спермы мыши, наложенный на последний кадр видеозаписи временного ряда реконструированных изображений (начальный сегмент в S1 Movie). Такие последовательности изображений также позволяют проследить большую часть жгутика. На рис. 1А (справа) показаны следы первого цикла биений жгутика (~ 0,3 с, что указывает на частоту биений ~ 3 Гц) и показано, что огибающая биений жгутиков составляла ~ 17 мкм на большей части его длины.

Рис 1.Прослеженные проекции в плоскости XY показывают четырехмерный характер жгутиковых волн свободно плавающих и привязанных сперматозоидов мышей.

(A) (слева) Путь свободно плавающего сперматозоида (зеленый), наложенный на реконструированную проекцию XY последнего кадра голографической записи 2,4 секунды S1 Movie; (справа) Жгутиковые следы, выбранные со скоростью 50 кадров в секунду для первого цикла биений (~ 0,29 с). Первая кривая (зеленая), последняя кривая (синяя). Огибающая формы сигнала (пунктирная линия) имеет ширину ~ 17 мкм. (B) Экскурсии в Z-плоскость, о которых сообщается путем опроса голографических записей с координатами x, y из следов на правой панели A.Данные Z-плоскости (выбранные со скоростью 50 кадров в секунду) были сглажены путем подгонки к полиномам 7-го порядка, а затем нанесены на график в зависимости от рассчитанного расстояния вдоль проекции XY жгутика (Dx, y). Полиномиальная регрессия использовалась для создания кривой наилучшего соответствия из нелинейных данных. Полиномиальные аппроксимации широко используются для описания формы волны жгутика [33–35]. Это помогает визуализировать данные, интерполировать промежутки между точками данных и удалить шум при определении значений z (см. Также S1 Fig).Соответствующие данные из кадра 0 показаны зеленым, из кадров 3, 6,… 51 – светло-черными, а данные из последних двух кадров (54 и 57) – серым и черным. (C) Динамика прохождения пиковых экскурсий в плоскости Z вниз по жгутику. Линии наименьших квадратов регрессии показывают скорость передвижения. (D) Жгутик той же клетки (синий) и его проекции (черный) на плоскости XY, XZ и YZ в момент времени t = 0 с (первый кадр 4D-анимации фильма S3). (E) (нижняя панель) Путь от головки связанного сперматозоида (зеленый), наложенный на проекцию XY последнего кадра 3-х секундной записи, выбранной со скоростью 100 кадров в секунду; (верхняя панель) жгутиковые следы, выбранные со скоростью 100 кадров в секунду для первого цикла биений (~ 0.16 с). Первая кривая – зеленая, последняя – синяя. (F) Сглаженные экскурсии в Z-плоскость, полученные путем опроса голографических записей с координатами x, y по трассам на верхней панели E. Соответствующие данные из кадра 1 показаны зеленым цветом, кадры 3, 5,… 21 – светлыми. черный, а кадры последних двух кадров (23 и 25) – насыщенный серый и черный.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0199678.g001

Важно отметить, что парные координаты x, y из этих жгутиковых следов позволяли запрашивать в голографических записях информацию о связанной Z-плоскости.Рис. 1B (для лучшего понимания см. Также S2 Movie) показывает, что отклонения Z-плоскости перемещались как волна вниз по жгутику. Огибающая бегущей волны в Z-плоскости (~ 14 мкм) была почти такой же большой, как огибающая ~ 17 мкм экскурсий в плоскость XY. Временной ход движения пика Z-плоскости вниз по жгутику (рис. 1C) показывает, что волна распространяется со средней линейной скоростью 421 ± 69 мкм / с ^-1 или 140 ± 23 мкм за цикл биений. Средняя скорость для 6 клеток из 3 экспериментов составляла 126 ± 16 мкм за цикл биений, что было достаточно для волны Z-плоскости, чтобы пройти вдоль жгутика длиной 125 мкм [31] один раз с каждым биением жгутика.Новая вторичная волна в Z-плоскости была инициирована примерно на полпути через эту последовательность, предположительно на переходе между главным и обратным изгибами жгутика [32], наблюдаемым в проекциях XY-плоскости.

Жгутиковые следы из 0,8 с видео реконструированной записи, выбранной на рис. 1A (фильм S1), дали матрицу значений x, y, z и t, которая позволила визуализировать жгутик в 4 измерениях. На рис. 1D показан жгутик во время начального следа (при t = 0 с) и его проекции на плоскости XY, XZ и YZ.S3 Movie анимирует последовательность, обеспечивая четырехмерную (4D) визуализацию жгутика этого свободно плавающего сперматозоида. Бегущая волна отклонений в плоскости Z (рис. 1B) хорошо видна на этом видео.

Сперматозоиды, которые слабо прикреплены (привязаны) к поверхности камеры в точке поворота головки, поворачиваются вокруг точки прикрепления при биении жгутика [14, 32]. Нижняя панель рис. 1E показывает, что путь центроида головки связанного сперматозоида образовал небольшую дугу, но клетка не продвигалась.Что касается свободно плавающих сперматозоидов, жгутиковые следы (верхняя панель на рис. 1E) предоставили координаты x, y, которые дали соответствующие данные Z-плоскости из голографических записей. На рис. 1F показано, что, как и для свободно плавающих сперматозоидов, отклонения в плоскости Z распространяются волной вниз по жгутику. Также, как и у свободно плавающих сперматозоидов, огибающая бегущей волны Z-плоскости (~ 14 мкм) была аналогична по размеру огибающей биения жгутика (показано на рис. 1E). В отличие от свободно плавающих сперматозоидов, линии регрессии экскурсий Z-плоскости для привязанной клетки имеют только отрицательные наклоны от их начала на проксимальном жгутике.Предположительно это следствие прикрепления кюветы к верхней поверхности камеры наблюдения. Это предположение было подтверждено открытием, что никакие другие объекты в том же поле зрения не имели координаты Z-плоскости больше, чем у центроида головы этой клетки.

Мы пришли к выводу, что форма волны жгутика свободно плавающих сперматозоидов мышей не плоская, а вместо этого имеет существенную компоненту Z-плоскости, создаваемую волнами отклонений Z-плоскости, которые сопровождают как основные, так и обратные изгибы, наблюдаемые в проекциях плоскости XY.Поскольку волны Z-плоскости также наблюдаются для связанных сперматозоидов, вращение сперматозоидов вокруг своей длинной оси не требуется для их производства.

DHM отслеживает пути плавания и качение сперматозоидов мыши

Извлечение информации о плоскости Z для жгутика (рис. 1) потребовало ручного отслеживания для получения координат x, y для запроса голографических записей. Для головки сперматозоида процесс был проще; его больший размер и лучшие преломляющие свойства обеспечивают более сильный сигнал, что позволяет программному обеспечению DHM Koala напрямую отслеживать голову в плоскостях X, Y и Z.Слежение выполняется покадрово по численно рассчитанным проекционным изображениям фокальных плоскостей в пределах расстояния восстановления. Для другой свободно плавающей клетки (вторичный сегмент S1 Movie) Рис. 2A – 2C показывают, что оси длиной 14 мкм позволяют визуализировать все точки вдоль пути плавания 2,2 секунды. Рис. 2D представляет собой трехмерное изображение этого пути, повернутого для просмотра приближающихся сперматозоидов в лоб. Начальная часть сопутствующего фильма S4 анимирует это вращение и движение по траектории. Цветовое кодирование экскурсий в плоскости Z подчеркивает сложный повторяющийся характер плавательной дорожки.

Рис. 2. Цифровая голографическая визуализация также обеспечивает четырехмерное описание траекторий плавания и качения сперматозоидов.

Путь головы другого свободно плавающего сперматозоида мыши с линейной усредненной траекторией проецировался на плоскость XY (A), плоскость YZ (B) и плоскость XZ (C). Равное масштабирование (14 мкм) всех осей. Экскурсии в Z-плоскости также имеют цветовую кодировку, как показано вертикальной полосой на панели D ниже. 2-й сегмент фильма S1 – это XY-проекции голографической записи 2,2 секунды.(D) Трехмерный вид пути плавания, красные шары указывают места пути, по которым ячейка катится из ориентации «LCh» в «RCh», синие шары указывают места, где ячейка катит «RCh» в «LCh». (E) (верхняя панель) Красные и синие полосы указывают периоды ориентации «RCh» и «LCh» для этой ячейки. Ориентация неопределенная в коротких белых областях. Изогнутые стрелки указывают на вращение по часовой или против часовой стрелки вокруг длинной оси ячейки. Также показана колеблющаяся интенсивность света, рассеянного от головки катящейся спермы (относительно фона из бесклеточной области).На нижней панели другой, не катящийся сперматозоид сохраняет ориентацию LCh и не имеет периодических колебаний интенсивности отраженного света. (F) Трехмерный вид круговой траектории этой некатящейся ячейки. Зеленый шар отмечает отправную точку. Шкала 14 мкм. Экскурсии в Z-плоскости имеют цветовую кодировку, как в D.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0199678.g002

Головка сперматозоида мыши имеет заднюю и вентральную поверхности (с дорсальной акросомой и вентральной шпорой). Таким образом, голова имеет левую и правую «щеки», а ориентация ячейки может быть описана как «самая нижняя правая щека» (RCh) или «крайняя левая щека» (LCh).Изучение временного ряда реконструированных изображений клетки на рис. 2A – 2D в плоскости XY показало, что перекатывание сперматозоидов от RCh-вниз до LCh-вниз (и , наоборот, ) вызывает кратковременное увеличение интенсивности света, отраженного от головка сперматозоида (верхняя панель на рис. 2E), что соответствует предыдущей работе с использованием традиционной светлопольной микроскопии [6]. Кроме того, большее увеличение и более короткое время освещения, используемые здесь для DHM, позволили визуализировать хиральность прокатки, показанную изогнутыми стрелками.Соответственно, сперматозоид катится против часовой стрелки при переходе от RCh- к LCh-самому низу, а затем всегда сопровождается вращением CW при переходе от LCh- к RCh-самому низу. В независимых слепых испытаниях группа из 3 наблюдателей приписывала одинаковые хиральности CW или CCW первым двум роликам, происходящим для сперматозоидов в каждой из тех же 10 репрезентативных видео-реконструкций свободно плавающих сперматозоидов. Каждый наблюдатель также исследовал прокрутку по всей длине (длительностью 1–3 с) 1 (назначенного случайным образом) видео из группы из 10 человек.Все наблюдатели сообщили, что броски CW неизменно следовали за бросками CCW (и , наоборот, ). Мы пришли к выводу, что сперматозоиды обладают хиральной памятью.

Сперма, исследованная на нижней панели фиг. 2E, оставалась в самой нижней ориентации LCh на протяжении всей записи 2,8 с. Как и ожидалось из прошлой работы [6], он не показал кратковременного увеличения интенсивности отраженного света, сообщающего о качении. Также, как и ожидалось, исходя из его ориентации LCh, его плавательный путь кружил по часовой стрелке (рис. 2F). Отклонения в плоскости Z для этой некатящейся ячейки были намного меньше, чем для вращающейся ячейки на рис. 2A-2D.Тем не менее, клетки, привязанные к голове для предотвращения перекатывания, все еще обнаруживают большие отклонения в плоскости Z жгутика (Fig 1F). Этот результат согласуется с наблюдениями за движением при низких числах Рейнольдса, когда силами инерции можно пренебречь. Как следствие, источником всех движений, включая вращение головы, является биение жгутиков [3, 36].

Сравнение времени переходов между конфигурациями RCh и LCh на рис. 2E с таковым для трехмерного профиля пути на рис. 2D показало, что перекатывание от RCh- к LCh-вниз происходит при пиковом положительном отклонении в Z-плоскость и что LCh – к РЧ-самому низу качение происходило при максимальном отрицательном вылете в Z-плоскость.Время этих прокатных событий отмечено красными и синими кружками на рис. 2D. Период между двумя кружками одного цвета составляет «цикл броска».

Корреляция между катящимися событиями и отклонениями в Z-плоскости позволяет несколько легче увидеть нерегулярную спиральную природу плавательной дорожки. Сопровождающий фильм S4 анимирует вращение Fig 2D, что позволяет более четко рассмотреть его трехмерный персонаж. Затем катящийся мяч повторяет ход этой последовательности во времени, показывая хиральность CW пути плавания, если смотреть лицом к приближающимся сперматозоидам.Другой вспомогательный фильм (фильм S5), показывающий анимацию свободно плавающей спермы с хиральностью пути по часовой стрелке, обеспечивает дополнительное прояснение структуры спиральной траектории.

Хиральность путей плавания сперматозоидов мыши из выравниваний Прокруста

Хотя поворот матрицы координат x, y, z позволил визуализировать хиральность пути плавания для ячейки на рис. 2A – 2D, процесс был громоздким и требовал субъективных оценок. В поисках более автоматизированной и объективной альтернативы мы обратились к выравниванию Procrustes, излюбленному инструменту морфометрического анализа [37].Анализ Прокруста, названный в честь злодейского бандита из греческой мифологии («носилки»), представляет собой статистический метод, который используется в основном для анализа формы в биологических или медицинских данных. Целью является сопоставление двух или более форм посредством наложения, в то время как форма определяется как конфигурация точек данных (ориентиров), организованных в матрицу. Анализ выполняется операциями симметрии с целью минимизировать сумму расстояний (расстояние Прокруста) между соответствующими точками данных от каждой формы.Математически за переносом следует поворот и изотропное изменение масштаба [38]. На рис. 3A показана траектория в плоскости XY ячейки на рис. 2A – 2D, масштаб которой изменен, чтобы подчеркнуть, что она включает 4 цикла перекатывания от RCh- до LCh-вниз, а затем обратно (сегменты между красными кружками). Чтобы применить выравнивание Прокруста (рис. 3B), начальные координаты x, y каждого из указанных сегментов цикла были перемещены в начало координат. Затем масштабирование и вращение были скорректированы для максимального сходства каждого сегмента с сегментом первого цикла.Наконец, скорректированные кривые были усреднены. Сходство трех выровненных циклов убедительно указывает на то, что их сложные траектории не были результатом случайного шума. Мы также отмечаем, что каждый выровненный цикл начинается с преимущественно непрерывной кривизны пути в плоскости XY, а затем демонстрирует резкий переходный переход в средней точке, когда ячейка катится от RCh- к LCh-самой нижней конфигурации.

Рис. 3. Прокрустовое совмещение траекторий головы свидетельствует о сохранении хиральности плавательных путей.

(A) Трехмерный вид траектории головки свободно плавающей спермы на рис. 2D.Шарики показывают перекатывание сперматозоидов из ЛЧ в РЧ (красный) и из РЧ в ЛЧ (синий). (B) Прокрустовое выравнивание траекторий в плоскости XY для 3 циклов переката (начиная сразу после переката от RCh к LCh, переходя через перекат от RCh к LCh и продолжая до нового поворота, затем обратно к RCh) в указанном диапазоне рамки для этой клетки. Черный след – их среднее значение. (C) Усредненное выравнивание Прокруста для ячеек, которые катились по часовой стрелке, а затем против часовой в течение 2–3 циклов поворота. Каждое усредненное выравнивание было перемещено, чтобы поместить начальную точку в начало координат (по 5 ячеек на каждой из 3 панелей).Изогнутая стрелка указывает на хиральность траектории, определяемую визуальной оценкой. (D) Усредненное выравнивание ячейки 1 из панели C (также исследованной на панелях A и B и на рис. 2) было преобразовано, чтобы поместить его начало в среднее значение X и среднее значение Y, а затем преобразовано в полярные координаты. (E) Динамика производной по времени угловой составляющей преобразованного выравнивания (dθ / dt) для ячейки 1. Красные и синие линии и крестики указывают сегменты ориентации RCh и LCh. (F) Определенное dθ / dt (среднее ± с.e.m.) для 10 ячеек из панели C (такая же цветовая кодировка).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0199678.g003

Усредненные выровненные траектории 15 ячеек, показанных на 3 панелях рис. 3C, отличаются в деталях, но все они показывают начальную кривизну CW с переходом средней точки. когда ячейка перекатывается в конфигурацию LCh. Поскольку плавательный путь первоначально перемещался вниз в Z-плоскости, когда клетки находились в конфигурации RCh, а затем перемещался вверх после перехода к LCh, траектории выглядят нерегулярно по спирали с хиральностью CW, показанной в анимационном фильме S4.

В поисках объективной меры хиральности траектории мы перевели усредненное выравнивание Прокруста для ячейки 1 на фиг. 3C в полярные координаты (фиг. 3D), а затем исследовали временной ход изменений ее угловой составляющей (θ). Производная по времени от тета (dθ / dt) затем сообщала, насколько быстро изменилась кривизна траектории и ее направление CW или CCW. На рис. 3E показано, что для этой ячейки dθ / dt было наибольшим в начале и около средней точки траектории, когда ячейка катится от LCh к RCh, а затем от RCh к LCh.Что еще более важно, данные на фиг. 3F показывают, что среднее значение dθ / dt для временного хода усредненного прокруста выравнивания ячейки 1 имело положительное значение (10,6 ± 2,8 радиан / с), указывающее на хиральность CW. Величина среднего диапазона dθ / dt составляла от 6,5 до 14,6 радиан / с для 10 ячеек, исследованных на рис. 3F, аналогично ~ 2-кратному диапазону их оцененных частот биений жгутиков. Что еще более важно, все они имели положительные значения, обеспечивающие количественную проверку того, что хиральность пути CW является общим свойством сперматозоидов мышей, исследованных в условиях, описанных здесь.

Жгутиковые формы волны и траектории свободно плавающих сперматозоидов быков и человека

В видеороликах репрезентативной свободно плавающей спермы быка, реконструированной из записей DHM, головка сперматозоида показывала линейную усредненную траекторию с ошеломляющими боковыми отклонениями и чередующимися периодами вперед и назад (левая панель на рис. 4A, начальный сегмент фильма S6). Средняя скорость пути 149 ± 12 мкм / с ^-1 и прогрессия 57 ± 12 мкм / с ^-1 (n = 27 клеток, N = 3) напоминали таковые для сперматозоидов мышей, исследованных в аналогичных условиях (скорость пути 168 ± 25 мкм с ^-1 и прогрессия 43 ± 11 мкм с ^-1 , n = 20 клеток, N = 5).Сравнение левых панелей на фиг. 4A и 1A показало, что траектории для спермы быков имели меньшие боковые отклонения, чем для сперматозоидов мышей, предположительно из-за их более коротких жгутиков и более симметричного биения жгутиков. Сравнение правых панелей на фиг. 4A и 1A показывает, что для сперматозоидов быков и мышей оболочки следов жгутиков имели аналогичный размер (~ 15 мкм).

Рис. 4. Голографическая визуализация обеспечивает четырехмерное описание формы волны жгутиков и траекторий плавания спермы быков.

(A) (слева) Путь от головы свободно плавающего сперматозоида быка (зеленый), наложенный на XY-проекцию последнего кадра голографической записи 1,8 с, снятой со скоростью 100 кадров в секунду, масштабные полосы 25 мкм; (справа) жгутиковые следы, отобранные со скоростью 50 кадров в секунду для первых 2 циклов биений (~ 0,5 с). Первая кривая (зеленая), последняя кривая (синяя). Огибающая формы волны ~ 25 мкм. (B) Экскурсии в Z-плоскости, путем опроса голографических записей с координатами x, y по трассам на правой панели A. Данные Z-плоскости, взятые из альтернативных кадров, сглаженные путем подгонки к полиномам 7-го порядка, нанесенные на рассчитанное расстояние вдоль XY проекция жгутика (Dx, y).Данные из кадра 0 – зеленого цвета, из кадров 2, 4,… 46 – черного, из кадров 48 и 50 – серого и черного. (C) Повернутая версия временного хода пути плавания выделена зеленым цветом с линией регрессии красного цвета, масштабные полосы 25 мкм (верхняя панель). Вертикальные стрелки показывают совпадение с пиками интенсивности света, рассеянного от головы (относительно бесклеточного фона, нижняя панель). (D) Трехмерный вид плавательного пути головки сперматозоида, зеленый кружок отмечает начало, светлые и жирные кружки отмечают локально-максимальные положительные и отрицательные отклонения в Z-плоскости.Масштаб по осям X, Y и Z составляет 140, 140 и 14 мкм. (E) Прокрустирует выравнивание указанных сегментов пути, черный – усредненное выравнивание. Светлый кружок отмечает начало координат, жирный кружок – середину усредненной трассы. (F) Трехмерный вид кругового пути другой ячейки, спроецированный на плоскость XY (верхняя панель), начало отмечается зеленым кружком. На средней панели показана проекция пути плавания в плоскости XY (шкала X и Y 140 мкм, шкала Z 14 мкм). Нижняя панель, динамика оптического сигнала от головы во время начальной 1.5-секундный отрезок пути (жирный зеленый на средней панели).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0199678.g004

Матрица координат x, y для жгутиковых следов на рис. 4A позволила извлечь соответствующие координаты Z-плоскости. На рис. 4В показано, что, что касается спермы мышей, размер отклонений Z-плоскости жгутиков сперматозоидов быка (~ 15 мкм) был аналогичен размеру жгутиковой оболочки в XY-плоскости, и что отклонения в Z-плоскости перемещались в виде волн вниз по поверхности. жгутик.

Также как и сперма мыши, сперма быка имеет сильно преломляющую головку, которая вызывает периодическое увеличение интенсивности отраженного света при вращении клетки (рис. 4C и начальный сегмент фильма S6).В отличие от спермы мышей, сперма быка (и сперма большинства других млекопитающих) не имеет различимых дорсальных и вентральных поверхностей под установкой DHM, поэтому было невозможно определить хиральность валиков, которые можно было увидеть при визуальном осмотре и динамика которых была изменена. сообщает об увеличении интенсивности оптического сигнала.

Фиг. 4D представляет собой трехмерное изображение пути головки сперматозоида на фиг. 4A – 4C, показанное с одинаковыми осями X и Y. Расширенная ось Z и поворот угла обзора были выбраны, чтобы показать, что синхронизация сигналов пиковой интенсивности (рис. 4C) поочередно коррелирует с локально максимальными отклонениями в положительной плоскости Z (светлые кружки) и локально с максимальными отклонениями в отрицательной плоскости Z ( жирные круги).Если бычья сперма также обладает хиральной памятью, обнаруженной для сперматозоидов мышей на фиг. 2, то эти открытые и темные кружки также будут отмечать чередующиеся события вращения по часовой стрелке и против часовой стрелки и противодействия качению.

На рис. 4E применены выравнивания Прокруста к указанным сегментам траектории в плоскости XY, которые охватывают 2 пика интенсивности, сигнализируя о 2 событиях качения, и которые вместе образуют цикл качения. Среднее значение совмещений показало, что траектория в плоскости XY искривлялась по часовой стрелке для тех сегментов, которые произошли после максимального положительного отклонения в плоскости Z.Такая кривизна CW указывает на то, что путь этого сперматозоида быка имел хиральность CW, как и у сперматозоидов мыши (рис. 3C и 3D).

В отличие от линейной усредненной траектории ячейки на фиг. 4A – 4E, ячейка на фиг. 4F завершила круговую (~ 120 мкм в диаметре) траекторию в течение ~ 7 секунд записи из 10 секунд (второй сегмент S6 Movie). В начальной части этой записи (жирная зеленая линия, средняя панель фиг. 4F) скорость пути составляла 122 ± 4 мкм с ^-1 . Интенсивность отраженного света (нижняя панель) не показывала периодических колебаний, что соответствовало отсутствию качения.Мы пришли к выводу, что, что касается спермы мышей, отсутствие качения позволило слегка асимметричному биению жгутика сперматозоидов быков создать круговую траекторию.

Трехмерное изображение траектории головки сперматозоида (верхняя панель рис. 4F) показывает, что отклонения в плоскости Z для этой вращающейся ячейки были намного меньше по размеру (почти все шаги на 1,4 мкм выше или ниже среднего положения оси Z). чем для ячейки с линейной траекторией (рис. 4A – 4D). Поскольку многие из указанных отклонений охватывали только один момент времени, вполне вероятно, что они были вызваны случайным шумом.Техника цифровой голографической микроскопии предусматривает численную обработку голограмм для восстановления количественных фазовых изображений. Этот расчет позволяет компенсировать экспериментальный шум, такой как временной дрейф или вибрация [39]. В дополнение к этому нет явных аберраций линз. Возможным источником шума может быть слабый контраст образца, например кончик жгутика, который напрямую влияет на отношение сигнал / шум. Ограниченная частота кадров камеры в корреляции со скоростью сперматозоидов также может вызвать аберрацию.Наконец, сама реконструкция определяет количество возможных значений z и, следовательно, разрешение по z.

На рис. 5А (слева) показан трек центроида головки типичного человеческого сперматозоида, наложенный на последний кадр видеозаписи его временной серии восстановленных изображений (третий сегмент в фильме S6). Отслеживание этой ячейки показало скорость пути 47 ± 2 мкм с ^-1 (общее среднее значение = 64 ± 11 мкм с ^-1 , n = 20 ячеек) и прогрессирование 13 мкм с ^-1 (общее среднее = 20 ± 6 мкм с ^-1 ).На рис. 5А (справа) показаны следы первого цикла биений жгутика (~ 0,14 с, что соответствует частоте биений ~ 7 Гц), которые указывают на то, что огибающая биений жгутиков составляла ~ 10 мкм на большей части его длины. Положения Z-плоскости жгутиков, полученные с использованием матрицы координат x, y из более длинной серии следов жгутиков, показали бегущие волны отклонений Z-плоскости (рис. 5B), размер которых также составлял ~ 10 мкм.

Рис. 5. Голографическая визуализация обеспечивает четырехмерное описание формы волны жгутиков и траекторий движения сперматозоидов человека.

(A) (левая панель) Путь от головки свободно плавающего человеческого сперматозоида (зеленый), наложенный на проекцию XY последнего кадра голографической записи 2,5 секунды, выбранной со скоростью 100 кадров в секунду; (правая панель) Жгутиковые следы, выбранные со скоростью 50 кадров в секунду для первых циклов биений (~ 0,29 с). Первая кривая (зеленая), последняя кривая (синяя). Огибающая формы волны ~ 15 мкм. (B) Экскурсии в Z-плоскость, о которых сообщается путем опроса голографических записей с координатами x, y из трасс на правой панели A. Данные Z-плоскости, выбранные со скоростью 50 кадров в секунду, были сглажены путем подгонки к полиномам 7-го порядка, затем наносится на график в зависимости от рассчитанного расстояния вдоль проекции XY жгутика (Dx, y).Соответствующие данные из кадра 1 показаны зеленым, кадры 3, 5,… 55 – черным, а кадры 57 и 59 – серым и черным. (C) (Верхняя панель) Повернутая версия хода движения по траектории, выделенная зеленым цветом, с линией регрессии траектории, выделенной красным, масштабные полосы составляют 25 мкм. (Нижняя панель) Динамика относительной интенсивности света, рассеянного от головы. (D) Трехмерное изображение плавательного пути головки сперматозоида, зеленый кружок отмечает начало, светлые и жирные кружки отмечают локально максимальные положительные и отрицательные отклонения в Z-плоскости.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0199678.g005

Головки сперматозоидов человека весьма разнообразны по морфологии [40] и имеют больше преломляющих поверхностей, чем у сперматозоидов мышей и быков. Эти свойства создают большую вариативность оптических сигналов, создаваемых качением. Динамический диапазон этих сигналов (нижняя панель на рис. 5C) также был меньше, чем у оптических сигналов от мыши и быка (рис. 2E и 4C), и их совпадение с изменениями траектории пути (верхняя панель на рис. 5C) было труднее увидеть. .

Фиг. 5D представляет собой трехмерное изображение начальной 1 секунды пути головки сперматозоида на фиг. 5A – 5C, показанное с равными осями X, Y и Z. Вращение угла обзора было выбрано для отображения времени максимальных отклонений в положительной плоскости Z (светлые кружки) и максимальных отклонений в отрицательной плоскости Z (жирные кружки). Без более прямого указания на качение мы не пытались приписать хиральность плавательной траектории. Никаких круговых путей не наблюдалось ни для одной из 20 клеток, отслеживаемых в этом исследовании.Следовательно, мы не смогли показать, что отсутствие качения коррелирует с круговыми путями плавания для спермы человека.

Таким образом, наиболее информативным является анализ плавательного поведения сперматозоидов мышей. Анализ поведения плавания спермы быков показывает сильное сходство со спермой мышей. С доступной в настоящее время методологией анализ поведения человеческой спермы при плавании более труден и менее информативен, но представляет собой отправную точку для будущих исследований.

Discussion

В настоящее время у нас есть достаточно подробные знания об архитектуре жгутика сперматозоидов млекопитающих и аксонеме 9 + 2, которая им управляет [23, 25, 41, 42].Однако мы знаем гораздо меньше о том, как этот механизм инициирует и распространяет жгутиковые волны [8, 9, 11, 12, 43–45]. Фактически, до сих пор нам не хватало детального изображения самой формы волны жгутиков. Настоящая работа применяет высокоскоростную DHM к бьющемуся жгутику сперматозоидов мышей, быков и человека и предоставляет количественные описания трехмерных форм волны жгутиков и их динамики.

Хотя в ранних работах было признано, что формы волны жгутиков сперматозоидов не являются полностью плоскими [46, 47], размер отклонений от плоскости XY оценивался только по потере фокуса, наблюдаемой с помощью объективов с высокой числовой апертурой [48-50], или по ширина максимумов интенсивности вдоль линии сканирования через жгутик [34].Теперь с помощью DHM мы видим, что жгутики свободно плавающих сперматозоидов совершают волны, отклоняющиеся от плоскости Z, которые имеют примерно такую ​​же амплитуду, что и волны в плоскости XY. Мы также видим, что возникновение волн жгутиковых Z-плоскости совпадает с инициированием основных и обратных изгибов жгутиков в XY-плоскости, и что волны Z-плоскости распространяются с постоянной скоростью вниз по жгутику. Эти новые количественные находки будут накладывать дополнительные ограничения на предложения по объяснению основы образования изгиба жгутиков.

Мы также обнаружили, что волны в плоскости Z по-прежнему производятся спермой мышей, которой препятствует скатывание путем привязки их голов к поверхности камеры. Следовательно, образование волн в плоскости Z не ограничивается вращением сперматозоидов вокруг своей длинной оси. Если скручивание, необходимое для перекатывания, является результатом движения волн в плоскости Z вниз по жгутику, то этот крутящий момент должен присутствовать и быть измеримым на головке связанного сперматозоида. Аллен [51] описал методы атомно-силовой микроскопии, которые могут быть применимы к таким измерениям.

Мы показываем, что для свободно плавающих сперматозоидов мышей, которые катятся, каждый валик приводит к временному увеличению интенсивности света, отраженного от головки сперматозоида. Этот оптический сигнал служит полезным маркером синхронизации событий качения, наблюдаемых здесь на реконструированных проекционных изображениях и в предыдущей работе [3, 6] с использованием обычных микроскопических изображений. Наблюдая за хиральностью событий качения на глаз, мы обнаруживаем, что качение по часовой стрелке и против часовой стрелки чередуется, образуя цикл противодействия качению.Используемые здесь объективы с более высокой числовой апертурой обеспечивают большую уверенность в задании хиральности прокатки, чем в задании, сделанном в предыдущей работе. Однако по-прежнему желателен менее субъективный количественный метод.

Исидзима и его коллеги изучали особый случай, когда сперма плавает вертикально вверх по покровному стеклу. В одном отчете [48] 76% голов спермы хомяков прокатились против часовой стрелки. Аналогичные пропорции спермы быка и человека также вращались против часовой стрелки. Однако в другом исследовании [52] было обнаружено, что большинство сперматозоидов хомячка вращаются по часовой стрелке, если смотреть спереди.Вулли [53] сообщил, что для сперматозоидов мышей, также плавающих вверх по покровному стеклу, все они вращались по часовой стрелке. Это открытие контрастирует с нашими наблюдениями, согласно которым для свободно плавающих сперматозоидов мышей за каждым вращением CW следует вращение CCW и , наоборот, . Объяснение этих различных результатов не очевидно. Возможно, лобовое столкновение с покровным стеклом выборочно подавляет качение CW или CCW.

Для объяснения постоянно чередующейся картины вращения CW и CCW, наблюдаемой для сперматозоидов мыши, мы предполагаем, что сперматозоид имеет хиральную память, которая хранит часть крутящего момента, необходимого для перекатывания, для повторного использования в следующем контр-валке.Ранние работы со спермой морского ежа также указали на наличие хиральной памяти. В частности, Гиббонс и его коллеги [54] увидели, что, когда головка сперматозоида удерживалась на кончике вибрирующей микропипетки, естественная плоскость биения жгутика изменялась на плоскость навязанной вибрации. Когда вибрация прекращается после нескольких полных оборотов плоскости вибрации, плоскость биения жгутика самопроизвольно «раскручивается» обратно в исходную, естественную плоскость биения [55, 56]. Эти наблюдения предполагали наличие упругой сдерживающей силы.Если такие упругие силы в сперме морского ежа и мыши имеют общую основу, то ответственный компонент (ы) не должен находиться во внешних волокнах или фиброзной оболочке, которые отсутствуют в сперматозоиде иглокожих.

Хотя настоящее исследование является первым применением цифрового голографического изображения для изучения путей плавания спермы мышей и быков, голографические изображения использовались в предыдущих высокопроизводительных исследованиях путей сперматозоидов человека [28] и лошади [26, 27]. В прошлой работе сообщалось, что «плоские» траектории в основном были обнаружены для сперматозоидов (~ 40% населения) вблизи границ камеры.Кажется вероятным, что такие траектории являются сегментами круговых дорожек плавания, которые мы находим для не катящихся сперматозоидов. В предыдущих исследованиях мы могли показать, что сперматозоиды не катящейся мыши остаются либо на левой, либо на правой щеке. Благодаря асимметричной форме головки сперматозоида мыши эти сперматозоиды становятся круговыми пловцами с либо CW (ориентация левой щеки), либо CCW (ориентация правой щеки) [6]. Еще около 25% популяции были описаны как имеющие траектории «витой ленты», которые авторы признали геликоидными поверхностями.Неправильные спиральные траектории, которые мы наблюдаем для наиболее свободно плавающих сперматозоидов, вероятно, также будут падать на такие геликоидные поверхности или рядом с ними. Моделирование геликоидных траекторий еще предстоит изучить.

Nosrati с соавторами [7, 57] обнаружили, что некоторые сперматозоиды быков и людей производили сигналы флуоресценции ближнего поля, происхождение которых было приписано плоским жгутиковым волнам клеток, плавающих в пределах 1 мкм от поверхности камеры. Однако мы обнаружили, что жгутики свободно плавающей спермы быка, как и у мышей, производят бегущие волны, перемещающиеся в Z-плоскость.Мы показываем, что эти отклонения в плоскости Z сохраняются даже тогда, когда сперматозоиды мыши привязаны на голове к поверхности камеры. Хотя привязанные бычьи и человеческие сперматозоиды не наблюдались с использованием используемых здесь протоколов, вполне вероятно, что экскурсии в Z-плоскости также сохранятся, когда станут доступны протоколы для привязанных бычьих и человеческих сперматозоидов. Если это так, то либо свободно плавающие сперматозоиды быка и человека обладают способностью подавлять отклонения Z-плоскости жгутиков, либо сигналы ближнего поля были неверно интерпретированы.

Плавательное поведение зеленых водорослей Chlamydomonas также хорошо изучено. Он использует форму волны брасса двух жгутиков, чтобы подтянуть тело клетки к более яркому освещению. Недавняя работа Гейера и соавторов [43] показала, что форма волны брасса имеет отдельные статические и динамические компоненты. Если смотреть в проекциях на плоскость XY, динамический компонент представляет собой бегущую волну, которая обеспечивает движение, а статический компонент представляет собой дугу окружности, которая управляет направлением плавания.Вспышка света высокой интенсивности вызывает реакцию избегания, вызванную подавлением статической составляющей, которая преобразует волну брасса в симметричную синусоидальную форму волны, которая отталкивает клетку от источника вредного стимула.

Для сперматозоидов проекции жгутиковых волн в плоскости XY имеют довольно синусоидальную форму в «условиях покоя», используемых в настоящем исследовании, что указывает на преобладание динамической составляющей формы волны. Сперма вырабатывает гораздо более асимметричную форму волны после воздействия «емкостных условий» [6, 14], которые, по-видимому, вызывают опосредованное Ca ²⁺ включение статической составляющей формы волны.Проникающие или вырезанные жгутики сохраняют способность Ca ²⁺ модулировать асимметрию формы волны [58], указывая тем самым, что Ca ²⁺ действует на компонент самой аксонемы. Молекулярная идентичность компонента (ов), чувствительного к Ca ²⁺ , неизвестна.

Статические и динамические компоненты формы волны жгутика водорослей можно разделить генетически. Динамический компонент существует в отсутствие статического компонента для мутанта Chlamydomonas mbo2 [43].Точно так же сперма мышей CatSper-null имеет синусоидальную форму волны с низкой асимметрией, но не развивает сильно асимметричную гиперактивированную форму волны [14]. Следовательно, различные мутанты CatSper-null могут рассматриваться как «фенокопии волновой формы» мутанта mbo2 , даже несмотря на то, что мутанты сперматозоидов и водорослей почти наверняка нарушают экспрессию неродственных белков-мишеней.

Не было показано, что жгутики Chlamydomonas создают волны отклонений в плоскости Z, подобные тем, которые проходят вниз по жгутику сперматозоидов, как показано здесь.Меньший размер и более высокая частота биений жгутиков водорослей (и подвижных ресничек, обнаруженных в других местах), вероятно, помешают исследованию с помощью голографической визуализации с использованием доступных в настоящее время инструментов. Между тем, проблема распространения формы волны была решена с помощью исследований 2D-моделирования, основанных на различных предсказаниях того, как механические силы, генерируемые аксонемой, действуют, регулируя его моторные белки [59]. Результаты показали, что модель контроля кривизны с аксонемным поворотом лучше всего соответствует волновым формам, наблюдаемым как для водорослей, так и для спермы быков.Это привело к заключению, что двигатели динеина управляют скольжением соседних дублетов микротрубочек и генерируют торсионные силы, которые скручивают аксонему, тем самым создавая непланарный компонент формы волны. Наша работа здесь обеспечивает измерения величины и динамики отклонений Z-плоскости, предположительно вызванных таким скручиванием.

Таким образом, DHM дала нам новое количественное понимание как формы волны жгутиков, так и плавательного поведения сперматозоидов. Применение DHM к сперматозоидам мышей было особенно информативным, открыв новые области для изучения того, как сперматозоиды генерируют, хранят и повторно используют скручивающие силы, лежащие в основе формы волны жгутиков.

Материалы и методы

Химические вещества

Все химические вещества были закуплены у Sigma-Aldrich.

Подготовка спермы и среда

После анестезии изофлураном и смещения шейки матки у мышей NMRI (Charles River Labs, Wilmington DE, США) вырезали хвостовые эпидидимиды и семявыносящие протоки, выделяли сперму и обрабатывали, как описано ранее [6]. Вкратце, сперматозоидам позволяли плавать в среде HS (в мМ: 135 NaCl, 5 KCl, 2 CaCl ₂ , 1 MgCl ₂ , 20 Hepes, 5 глюкозы, 10 DL-молочной кислоты и 10 пировиноградной кислоты, pH 7.4) в течение 20 мин при 37 ° C и 5% CO ₂ . После двух стадий промывки (осаждение в течение 3 минут при 400 x g) сперматозоиды ресуспендировали до конечной концентрации 1-2 x 10 ⁷ клеток / мл в среде HS с 5 мг / мл BSA или без него и хранили при комнатной температуре. Сперма с эякуляцией крупного рогатого скота, полученная от быка голштино-фризской породы (HB-No 678525), была щедрым подарком Rinder-Union West eG (Мюнстер, Германия) и доставлена ​​из местного отделения в нашу лабораторию в течение 2 часов после сбора. Группа из 3 доноров предоставила эякулированную человеческую сперму, собранную в соответствии с утвержденными этическими протоколами и позволившую разжижиться при RT.Этическое одобрение было получено от местного этического комитета медицинского факультета (Университет Дуйсбург-Эссен, файл № 14-5748-BO). Пропорции подвижных сперматозоидов быка и человека были увеличены с помощью процедуры всплытия. Вкратце, на 1 мл эякулята накладывали 4 мл HS и инкубировали 1 час при 37 ° C и 5% CO ₂ . Подвижные сперматозоиды отбирали из наложенной среды. Аликвоты препаратов переносили на предметные стекла глубиной 20 или 100 мкм (Leja, Nieuw-Vennep, Нидерланды).Все изображения проводились в течение 3 часов после подготовки образца. Сперматозоиды мышей и быков визуализировали при 20-кратном увеличении, а сперматозоиды человека – при 40-кратном увеличении (в отношении линзы объектива).

Голографические изображения

Цифровой голографический микроскоп DHM ™ T-1000 (Lyncée Tec SA, Лозанна, Швейцария) работает в режиме внеосевого пропускания [30, 60]. В его состав входят лазерный диодный источник с длиной волны 666 нм, объективы 10x / 0,3 NA, 20x / 0,4 NA и 40x / 0,6 NA, а также камера Basler avA1000-100gm CCD (Basler AG, Аренсбург, Германия).Заводские калибровки определяют разрешение системы 3,7466 и 7,4931 пикселей / мкм с использованием поставляемых объективов с 20-кратным и 40-кратным увеличением. Поставляемое патентованное программное обеспечение Koala (V6) и Spyder с открытым исходным кодом позволяет обрабатывать сохраненные голографические изображения в автономном режиме. Коала численно рассчитывает проекционные изображения образца в плоскости XY в различных фокальных плоскостях [30, 60]. С помощью специально разработанных скриптов Spyder, Коала также может отслеживать головки сперматозоидов и сообщать координаты плоскостей X, Y и Z для идентифицированных траекторий.В некоторых случаях центроид головки и связанная с ней интенсивность также отслеживались с помощью подключаемого модуля Manual Tracking из коллекции MBF для изображения J. Для определения координат X-, Y- и Z-плоскостей жгутика сперматозоидов требовалась предварительная рамка. покадровая трассировка изображения жгутика в стопках реконструированных проекций XY с использованием макроса, написанного в среде программирования Igor Pro ™ (Wavemetrics, Lake Oswego OR, США). Сценарий, подготовленный в Spyder, затем позволил опросить Коалу с помощью матрицы координат жгутика x, y, чтобы получить соответствующие координаты Z-плоскости.Расстояние вдоль жгутика в проекциях XY (Dx, y) определяли геометрически по соседним парам координат x, y.

Анализ изображений

Временные ряды реконструированных проекционных изображений XY (8-битный формат TIFF, 100 кадров в секунду) поддерживались в формате 800 x 800 пикселей, исходном для записывающей камеры. Перед отслеживанием изображений жгутиков в копии временного ряда в ImageJ были применены автокоррекции контрастности и яркости изображения. Для отслеживания траекторий клеток и мониторинга интенсивности центроида головы нескорректированный временной ряд был обрезан до прямоугольного поля зрения, исключающего области за пределами огибающей траектории клетки.Для производства связанных поддерживающих видеороликов стек обрезанных изображений получил автоматическую настройку контрастности и яркости изображения в ImageJ перед сохранением в формате AVI с использованием сжатия JPEG.

Для визуализации жгутика сперматозоидов в 4D использовался специально разработанный скрипт Spyder, предоставленный Lyncée Tec SA. Визуализация траекторий плавания сперматозоидов в 4D с использованием функции Gizmo от IgorPro. Функции IgorPro также производили выравнивание Прокруста и визуализацию траекторий пути в полярных координатах.Все эксперименты проводились при комнатной температуре.

Статистика

Численные результаты представлены как среднее ± стандартное отклонение. где n = количество определений и N = количество независимых экспериментов.

Дополнительная информация

S1 Movie. Периодическая прокатка сперматозоидов.

Сперматозоиды мыши в свободном плавании, как видно на временном ряду 2,6 с реконструированных проекций на плоскость XY (100 кадров в секунду, автоусиление яркости и контрастности), за которым следует временной ряд 2,3 с от другого свободно плавающего сперматозоида.Эти Avis для ячеек с рисунков 1A – 1D и 2A – 2E иллюстрируют периодическое переключение ячейки между конфигурациями RCh и LCh.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0199678.s001

(AVI)

S2 Фильм. Экскурсии в плоскости Z сперматозоидов.

Анимация прохождения сглаженных волн жгутиковой плоскости Z, движущихся вниз по жгутику в течение ~ 2 циклов биений клетки с рис. 1. Последовательные кадры добавляют данные, взятые из каждого второго кадра, как на рис. 1В. Первая кривая – зеленая, последняя – тяжелая черная, предпоследняя – тяжелая серая.Отметка времени указывает прошедшее время.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0199678.s002

(AVI)

S3 Movie. 3D-проекция жгутика сперматозоидов.

Жгутик сперматозоида в 4D, как показано на анимации 3D-проекции на рис. 1D (синяя кривая), и его проекции на плоскости XY, XZ и YZ. Выборка 100 Fps. Бегущие волны экскурсий в плоскости Z легко увидеть.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0199678.s003

(AVI)

S4 Movie.Реконструированная траектория сперматозоида.

Анимированный поворот восстановленной траектории ячейки на рис. 2D, чтобы более четко показать ее трехмерный характер. После 2 полных оборотов шаг регулируется так, чтобы оптимально отображать траекторию, если смотреть лицом к приближающейся ячейке. Наконец, катящийся шар отслеживает ход траектории во времени, демонстрируя его хиральность CW.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0199678.s004

(AVI)

S5 Movie.Анимация спиральной траектории сперматозоида.

Анимированная траектория свободно плавающей спермы быка в течение 2,5 секунд. Последовательность показана дважды в разных ракурсах. Зеленый шарик определяет местонахождение головки сперматозоида, а цветовой код траектории отображает значение z. Зеленая спираль, которая следует по пути, и проекция в полярной системе координат в верхнем левом углу видео указывают на хиральность пути по часовой стрелке.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0199678.s005

(AVI)

S6 Фильм. Реконструированные проекции DHM спермы быка и человека.

Показывает временные ряды 100 кадров в секунду реконструированных проекций на плоскость XY для 3 сперматозоидов. Первый сегмент предназначен для свободно плавающей спермы быка на рис. 4A – 4E, демонстрируя периодическое вращение клетки вокруг своей длинной оси. Второй сегмент показывает еще одну свободно плавающую сперму быка, не катящуюся сперму, показанную на фиг. 4F. Третий сегмент показывает свободно плавающую человеческую сперму, клетку на рис. 5A – 5D.Колебания интенсивности головы указывают на периодическое вращение клетки вокруг своей длинной оси.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0199678.s006

(AVI)

S1 Рис. Полиномиальный регрессионный анализ экскурсий в z-плоскости.

Полиномиальная регрессия доказывает, что данные экскурсии в плоскости z адекватно подходят. На рисунке показаны первые кадры рис. 1B в виде отклонений Z-плоскости, сглаженных полиномом 7-го порядка. Согласно фиг.1B, первый кадр 0 – зеленый. Данные перекрываются маркерами, которые показывают неподходящие данные соответствующим цветом.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0199678.s007

(TIF)

Благодарности

Мы благодарны Д. Ф. Бэбкоку за техническую и редакционную помощь. Мы благодарны A.G. из Wavemetrics, Inc. за помощь с выравниванием Procrustes, T. Colomb из Lyncée Tec SA за помощь со скриптами Spyder и U. Janowitz из Rinder-Union West eG за предоставление спермы крупного рогатого скота. Мы также благодарим C.J. Brokaw, Калифорнийский технологический институт, C.B. Lindemann из Оклендского университета и C.Л. Асбери, Вашингтонский университет за полезные обсуждения, и Дж. Щирба, Университет Дуйсбург-Эссен за критическую и тщательную вычитку. Поддержка была предоставлена ​​DFG WE 2344 / 9-1 компании G.W. Мы благодарим за поддержку Фонд публикаций открытого доступа Университета Дуйсбург-Эссен.

Ссылки

1. 1. Хино Т., Муро Й., Тамура-Накано М., Окабе М., Татено Х., Янажимачи Р. Поведение и акросомный статус сперматозоидов мышей in vitro и внутри яйцевода во время оплодотворения после естественного спаривания.Биол Репрод. 2016; 95 (3): 50. pmid: 27417908.
2. 2. Исикава Ю., Усуи Т., Ямасита М., Канемори Ю., Баба Т. Серфинг и плавание эякулированной спермы в мышином яйцеводе. Биол Репрод. 2016; 94 (4): 89. pmid: 26962118.
3. 3. Miki K, Clapham DE. Реотаксис направляет сперму млекопитающих. Curr Biol. 2013. 23 (6): 443–52. pmid: 23453951; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC3607503.
4. 4. Суарес СС, Пейси А.А. Транспорт спермы в женских половых путях. Обновление Hum Reprod.2006. 12 (1): 23–37. pmid: 16272225.
5. 5. Янагимачи Р. Оплодотворение млекопитающих. Рэйвен, Нью-Йорк. 1994: 189–317.
6. 6. Бэбкок Д.Ф., Вандернот П.М., Веннемут Г. Эпизодические перекатывания и временные привязанности создают разнообразие в поведении при плавании сперматозоидов. BMC Biol. 2014; 12: 67. pmid: 25182562; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC4354980.
7. 7. Носрати Р., Дриучи А., Ип С.М., Синтон Д. Двумерное скользящее плавание спермы в пределах микрометра поверхности.Nat Commun. 2015; 6: 8703. pmid: 26555792; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC4667638.
8. 8. Brokaw CJ. Подумайте о колебаниях жгутиков. Цитоскелет клеточного мотиля. 2009. 66 (8): 425–36. pmid: 18828155.
9. 9. Brokaw CJ. Компьютерное моделирование движения жгутиков X: расщепление пар дублетов и распространение изгиба, смоделированные с использованием стохастической кинетики динеина. Цитоскелет (Хобокен). 2014. 71 (4): 273–84. pmid: 24574072.
10. 10. Фридрих Б.М., Ридель-Крузе И.Х., Ховард Дж., Юличер Ф.Высокоточное отслеживание тонкой структуры плавания сперматозоидов обеспечивает надежную проверку теории силы сопротивления. J Exp Biol. 2010. 213 (Pt 8): 1226–34. pmid: 20348333.
11. 11. Lindemann CB, Lesich KA. Биение жгутиков и ресничек: доказанное и возможное. J Cell Sci. 2010. 123 (Pt 4): 519–28. pmid: 20145000.
12. 12. Woolley DM. Жгутиковые колебания: комментарий к предлагаемым механизмам. Биол Рев Камб Филос Соц. 2010. 85 (3): 453–70. pmid: 20002389.
13. 13.Карлсон А.Е., Хилле Б., Бэбкок Д.Ф. Внешний Ca2 + действует выше аденилатциклазы SACY в бикарбонатном сигнале активации подвижности сперматозоидов. Dev Biol. 2007. 312 (1): 183–92. pmid: 17950270; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC2259292.
14. 14. Карлсон А.Е., Вестенбрук Р.Э., Куилл Т., Рен Д., Клэпхэм Д.Э., Хилле Б. и др. CatSper1 необходим для вызванного входа Ca2 + и контроля функции жгутиков в сперматозоидах. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2003; 100 (25): 14864–8. pmid: 14657352; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC299831.
15. 15. Дудики Т., Кадунганаттил С., Феррара Дж. К., Клайн Д. В., Виджаярагхаван С. Изменения в карбоксиметилировании и фосфорилировании тирозина протеинфосфатазы PP2A связаны с созреванием и подвижностью эпидидимальных сперматозоидов. PLoS One. 2015; 10 (11): e0141961. pmid: 26569399; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC4646675.
16. 16. Янсен В., Альварес Л., Бальбах М., Стрункер Т., Хегеманн П., Каупп У.Б. и др. Контроль за оплодотворением и передачей сигналов цАМФ в сперматозоидах с помощью оптогенетики.Элиф. 2015; 4. pmid: 25601414; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC4298566.
17. 17. Нолан М.А., Бэбкок Д.Ф., Веннемут Г., Браун В., Бертон К.А., Макнайт Г.С. Спермоспецифическая протеинкиназа Каталитическая субъединица Calpha2 управляет передачей сигналов цАМФ для мужской фертильности. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2004; 101 (37): 13483–8. pmid: 15340140; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC518783.
18. 18. Ци Х., Моран М.М., Наварро Б., Чонг Дж. А., Крапивинский Г., Крапивинский Л. и др. Все четыре белка ионного канала CatSper необходимы для мужской фертильности и гиперактивированной подвижности сперматозоидов.Proc Natl Acad Sci U S. A. 2007; 104 (4): 1219–23. pmid: 17227845; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC1770895.
19. 19. Wandernoth PM, Mannowetz N, Szczyrba J, Grannemann L, Wolf A, Becker HM и др. Нормальная фертильность требует экспрессии углекислых ангидраз II и IV в сперме. J Biol Chem. 2015. 290 (49): 29202–16. pmid: 26487715; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC4705926.
20. 20. Веннемут Дж., Вестенбрук РЭ, Сюй Т., Хилле Б., Бэбкок Д.Ф. Ca2 + каналы CaV2.2 и CaV2.3 (N- и R-типа) в вызванном деполяризацией проникновении Ca2 + в сперматозоиды мыши.J Biol Chem. 2000. 275 (28): 21210–7. pmid: 107
    .
21. 21. Xie F, Garcia MA, Carlson AE, Schuh SM, Babcock DF, Jaiswal BS и др. Растворимая аденилатциклаза (sAC) незаменима для функции сперматозоидов и оплодотворения. Dev Biol. 2006. 296 (2): 353–62. pmid: 16842770.
22. 22. Авата Дж., Сонг К., Лин Дж., Кинг С.М., Сандерсон М.Дж., Никастро Д. и др. DRC3 подключает N-DRC к динамику для регулирования формы волны жгутиков. Mol Biol Cell. 2015; 26 (15): 2788–800. pmid: 26063732; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC4571338.
23. 23. Хойзер Т., Барбер К.Ф., Лин Дж., Крелл Дж., Ребеско М., Портер М.Э. и др. Криоэлектронная томография выявляет дуплет-специфические структуры и уникальные взаимодействия в динеине I1. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2012; 109 (30): E2067–76. pmid: 22733763; PubMed Central PMCID: PMCPMC3409752.
24. 24. Оунджай П., Ким К.Д., Лишко П.В., Даунинг К.Х. Трехмерная структура соединительного элемента бычьей спермы, выявленная с помощью электронной криотомографии. Биол Репрод. 2012; 87 (3): 73.pmid: 22767409; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC3464910.
25. 25. Satir P, Heuser T, Sale WS. Структурная основа того, как работают подвижные реснички. Биология. 2014. 64 (12): 1073–83. pmid: 26955066; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC4776691.
26. 26. Су Т.В., Чой И., Фенг Дж., Хуанг К., МакЛеод Э., Озкан А. Траектории сперматозоидов образуют хиральные ленты. Научный доклад 2013; 3: 1664. pmid: 23588811; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC3630328.
27. 27. Су ТВ, Чой И, Фенг Дж, Хуанг К., Озджан А.Высокопроизводительный анализ трехмерных моделей плавания спермы лошадей с использованием компьютерной визуализации на кристалле. Anim Reprod Sci. 2016; 169: 45–55. pmid: 26826909.
28. 28. Су ТВ, Сюэ Л., Озкан А. Высокопроизводительное трехмерное отслеживание человеческих сперматозоидов без линз позволяет выявить редкую статистику спиральных траекторий. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2012; 109 (40): 16018–22. pmid: 22988076; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC3479566.
29. 29. Джикели Дж. Ф., Альварес Л., Фридрих Б. М., Уилсон Л. Г., Паскаль Р., Колин Р. и др.Навигация сперматозоидов по спиральным траекториям в трехмерных ландшафтах хемоаттрактантов. Nat Commun. 2015; 6: 7985. pmid: 26278469; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC4557273.
30. 30. Коломб Т., Павильон Н., Кун Дж., Куч Э, Деперсинг С., Эмери Ю. Увеличенная глубина резкости с помощью цифровой голографической микроскопии. Opt Lett. 2010. 35 (11): 1840–2. pmid: 20517434.
31. 31. Cummins JM, Woodall PF. О размерах сперматозоидов млекопитающих. J Reprod Fertil. 1985. 75 (1): 153–75. pmid: 4032369.
32. 32. Веннемут Г., Карлсон А. Е., Харпер А. Дж., Бэбкок Д. Ф.Действие бикарбоната на ответы жгутиков и Са2 + -каналов: начальные события активации сперматозоидов. Разработка. 2003. 130 (7): 1317–26. pmid: 12588848.
33. 33. Сюй Г., Уилсон К.С., Окамото Р.Дж., Шао Дж.Й., Датчер С.К., Бейли П.В. Жесткость при изгибе и жесткость жгутика при сдвиге, оцененная по индуцированным изгибам и встречным изгибам. Biophys J. 2016; 110 (12): 2759–68. Epub 2016/06/23. pmid: 27332134; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC4^7.
34. 34. Букатин А., Кухтевич И., Ступ Н., Дункель Ю., Канцлер В.Бимодальное реотаксическое поведение отражает асимметрию биений жгутиков в сперматозоидах человека. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2015; 112 (52): 15904–9. pmid: 26655343; PubMed Central PMCID: PMCPMC4703022.
35. 35. Бейли П.В., Льюис Б.Л., Кемп П.С., Плесс РБ, Датчер СК. Эффективный пространственно-временной анализ формы волны жгутика Chlamydomonas reinhardtii. Цитоскелет (Хобокен). 2010. 67 (1): 56–69. Epub 2010/02/20. pmid: 20169530; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC4109274.
36. 36. Канцлер В, Дункель Дж, Блейни М, Голдштейн РЭ.Реотаксис облегчает навигацию вверх по потоку сперматозоидов млекопитающих. Элиф. 2014; 3: e02403. pmid: 24867640; PubMed Central PMCID: PMC4031982.
37. 37. Klingenberg CP. Размер, форма и форма: понятия аллометрии в геометрической морфометрии. Dev Genes Evol. 2016; 226 (3): 113–37. pmid: 27038023; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC4896994.
38. 38. Gower JC. Обобщенный анализ прокруста. Психометрика. 1975. 40 (1): 33–51. WOS: A1975AC302.
39. 39. Rappaz B, Cano E, Colomb T., Kuhn J, Depeursinge C, Simanis V, et al.Неинвазивная характеристика клеточного цикла делящихся дрожжей путем мониторинга сухой массы с помощью цифровой голографической микроскопии. J Biomed Opt. 2009; 14 (3): 034049. Epub 2009/07/02. pmid: 19566341.
40. 40. Mai A, Weerachatyanukul W, Tomietto M, Wayner DD, Wells G, Balhorn R и др. Использование атомно-силовой микроскопии для морфологического и морфометрического анализа неповрежденных акросом и сперматозоидов человека, вступивших в реакцию с акросомами. Mol Reprod Dev. 2002. 63 (4): 471–9. pmid: 12412050.
41. 41. Heuser T, Dymek EE, Lin J, Smith EF, Nicastro D.CSC соединяет три основных комплекса аксонем, участвующих в регуляции динеина. Mol Biol Cell. 2012. 23 (16): 3143–55. pmid: 22740634; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC3418309.
42. 42. Инаба К. Жгутики сперматозоидов: сравнительные и филогенетические перспективы белковых компонентов. Мол Хум Репрод. 2011; 17 (8): 524–38. pmid: 21586547.
43. 43. Гейер В.Ф., Сартори П., Фридрих Б.М., Юличер Ф., Ховард Дж. Независимый контроль статических и динамических компонентов жгутиковых ударов хламидомонады.Curr Biol. 2016; 26 (8): 1098–103. pmid: 27040779.
44. 44. Исидзима С. Самостоятельное колебательное скользящее движение дублетных микротрубочек и образование жгутикового изгиба. PLoS One. 2016; 11 (2): e0148880. pmid: 26863204; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC4749303.
45. 45. Lindemann CB, Lesich KA. Функциональная анатомия жгутика сперматозоидов млекопитающих. Цитоскелет (Хобокен). 2016. 73 (11): 652–69. pmid: 27712041.
46. 46. Филлипс DM. Сравнительный анализ подвижности сперматозоидов млекопитающих.J Cell Biol. 1972; 53 (2): 561–73. pmid: 5025110; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC2108714.
47. 47. Рикменспоэль Р. Хвостовое движение сперматозоидов быков. Наблюдения и модельные расчеты. Biophys J. 1965; 5 (4): 365–92. pmid: 5893155; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC1367881.
48. 48. Исидзима С., Хамагути М.С., Нарусэ М., Исидзима С.А., Хамагучи Ю. Вращательное движение сперматозоида вокруг его длинной оси. J Exp Biol. 1992; 163: 15–31. pmid: 1556511.
49. 49. Вулли Д.М., Осборн И.В.Трехмерная геометрия подвижных сперматозоидов хомяка. J Cell Sci. 1984; 67: 159–70. pmid: 6746770.
50. 50. Йунг СН, Вулли ДМ. Распространение трехмерного изгиба в моделях спермы хомяков и направление вращения в свободно плавающих клетках. Cell Motil. 1984. 4 (3): 215–26. pmid: 6744387.
51. 51. Аллен М.Дж., Радд Р.Э., МакЭлфреш М.В., Балхорн Р. Временные измерения наномасштабного импульса силы, управляемого аксонемными динеиновыми двигателями в отдельных живых сперматозоидах. Наномедицина.2010. 6 (4): 510–5. pmid: 20060073.
52. 52. Исидзима С., Хамагучи Ю. Взаимосвязь между направлением качения и рыскания сперматозоидов золотого хомяка и морского ежа. Функция сотовой структуры. 1992. 17 (5): 319–23. pmid: 1473162.
53. 53. Woolley DM. Подвижность сперматозоидов на поверхностях. Репродукция. 2003. 126 (2): 259–70. pmid: 12887282.
54. 54. Гиббонс И.Р., Шингёдзи С., Мураками А., Такахаши К. Спонтанное выздоровление после экспериментальной манипуляции с плоскостью биений в жгутиках сперматозоидов.Природа. 1987. 325 (6102): 351–2. pmid: 3808030.
55. 55. Эшел Д., Шингёдзи С., Йошимура К., Гиббонс Б.Х., Гиббонс И.Р., Такахаши К. Временное поведение жгутиков сперматозоидов морского ежа после резкого изменения частоты биений. J Exp Biol. 1990; 152: 441–51. pmid: 2230640.
56. 56. Shingyoji C, Katada J, Takahashi K, Gibbons IR. Вращение плоскости навязанной вибрации может вращать плоскость биения жгутиков в сперматозоидах морского ежа без скручивания аксонемы. J Cell Sci.1991; 98 (Pt 2): 175–81. pmid: 2055955.
57. 57. Носрати Р., Грэм П.Дж., Лю К., Синтон Д. Преобладание движения сперматозоидов в углах. Научный доклад 2016; 6: 26669. pmid: 27211846; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC4876399.
58. 58. Лесич К.А., де Пиньо Т.Г., Данг Л., Линдеманн СВ. Ультраструктурные доказательства того, что изменения подвижности, вызванные вариациями АТФ, Mg2 + и ADP, коррелируют с конформационными изменениями в реактивированных аксонемах сперматозоидов быка. Цитоскелет (Хобокен). 2014. 71 (11): 649–61.pmid: 25430605.
59. 59. Сартори П., Гейер В.Ф., Ховард Дж., Юличер Ф. Регулировка кривизны цилиарного биения посредством аксонемного скручивания. Phys Rev E. 2016; 94 (4–1): 042426. Epub 2016/11/15. pmid: 27841522.
60. 60. Rappaz B, Marquet P, Cuche E, Emery Y, Depeursinge C, Magistretti P. Измерение интегрального показателя преломления и динамической клеточной морфометрии живых клеток с помощью цифровой голографической микроскопии. Opt Express. 2005; 13 (23): 9361–73. pmid: 19503137.

радиальных спиц – снимок регуляции подвижности, сборки и эволюции ресничек и жгутиков

% PDF-1.4 % 141 0 объект > эндобдж 140 0 объект > поток 2017-04-21T09: 14: 21 + 05: 30Arbortext Advanced Print Publisher 9.1.520 / W2021-11-26T03: 53: 09-08: 002021-11-26T03: 53: 09-08: 00Acrobat Distiller 8.1.0 ( Windows) application / pdf