Шампунь из горчицы: Горчица как шампунь для укрепления и усиления роста волос — www.wday.ru

Люди, которые смотрели это, также смотрели

За этикеткой «Только для внешнего использования»

Из-за ошибки редактирования в исходный текст было включено неточное описание насыщенных жиров.Текст обновлен. Мы сожалеем об ошибке.

Когда я был подростком, мой отец прошел этап маринования всего, что мог. Казалось, что каждая банка, которую он мог достать, неизбежно будет наполнена пряными овощами – всем, от баклажанов и моркови до фруктов, таких как зеленые манго, – и поставлена ​​на наши подоконники, чтобы маринады сохли на солнце.

Индийские соленые огурцы – или ачара , как их обычно называют – отличаются от солений, с которыми знакомо большинство неиндийских людей.Хотя аахары маринуют с использованием соли, кислоты и иногда сахара, они также полагаются на комбинации специй и масел, чтобы придать овощам аромат и создать условия, неблагоприятные для вредных бактерий.

В Индии тип масла, используемого на кухне, меняется в зависимости от географического положения и оказывает сильное влияние на региональные кухни. Например, в более теплых частях страны кунжутное масло используется во многих рецептах, и в результате многие блюда в этих регионах характеризуются ореховым ароматом кунжутного масла.Но на севере преобладает масло, извлекаемое из семян горчицы, что придает безошибочный аромат васаби многим блюдам, особенно аахарам, таким как те, что делал мой отец.

Горчичное масло – чрезвычайно популярное масло среди домашних поваров в Китае, России и в Южной Азии, особенно в северном индийском штате Западная Бенгалия, а также в Бангладеш и Пакистане. В отличие от масел, которые просто пропитаны семенами горчицы, настоящее горчичное масло – это жир, извлеченный из семян горчичного растения. В Индии масло получают из семян черной горчицы сорта Brassica nigra .В России и Китае его получают из семян бурой горчицы сорта Brassica juncea .

Как и большинство кулинарных масел, горчичное масло имеет множество применений. Вы можете использовать его для обжаривания или обжаривания овощей, а его ароматические качества делают его идеальным для разогрева специй и чили для тадка – горячего масла с приправами, которое используется в качестве завершающего штриха для многих блюд. Кроме того, поскольку у него особенно высокая температура дымления – около 480 ° F [248,89 ° C], что выше, чем у рапсового или даже виноградного масла, это отличный жир для жарки во фритюре, например, кусочков свежей рыбы в кляре и его можно использовать вместо оливкового масла при жарке овощей.

Почему горчичное масло помечено «Только для наружного применения»

Несмотря на популярность горчичного масла в некоторых частях мира, его продажа в Соединенных Штатах в съедобных целях запрещена, а бутылки с горчичным маслом должны продаваться с этикетками, на которых указано «Только для внешнего использования». В голову приходит очевидный вопрос, который мне часто задают: «Ну, если это нормально для людей в Индии, почему мы не можем приготовить и съесть это здесь? Индийцы готовили из этого на протяжении веков, и они в порядке.”

Чтобы понять, почему ограничена продажа горчичного масла, необходимо более внимательно изучить его состав. Все жиры и масла состоят из комбинации глицерина и смеси молекул, называемых жирными кислотами, и состав жирных кислот в данном масле или жире определяет их поведение. Например, жиры с высоким содержанием насыщенных * жирных кислот – животные жиры, такие как сало и жир, и некоторые жиры растительного происхождения, такие как кокосовое масло, – будут вести себя как твердые вещества при комнатной температуре.Жиры с более высоким содержанием ненасыщенных жирных кислот, например оливковое и арахисовое масло, при комнатной температуре ведут себя как жидкости.

* Для получения дополнительной информации о различиях между насыщенными и ненасыщенными жирами щелкните здесь.

Горчичное масло богато ненасыщенными жирными кислотами, но оно также содержит особый тип жирной кислоты, называемой эруковой кислотой, которая лежит в центре споров вокруг этого масла. Семена растений семейства капустных, в которое входят рапс и горчица, а также капуста и капуста, все содержат разное количество эруковой кислоты.Ранние экспериментальные исследования на животных в 1950-х годах показали, что эруковая кислота, возможно, сыграла роль в развитии сердечных заболеваний.

У этого исследования было два заметных следствия. Во-первых, в ответ на это канадские ученые создали масло канолы (комбинация слов «Канада» и « ola », старое английское слово, обозначающее нефть, хотя некоторые говорят, что «ола» является аббревиатурой для « масло с низким содержанием кислоты ») путем тщательной селекции растений рапса, которые дали семена с чрезвычайно низким уровнем эруковой кислоты.(Они также очистили масло с помощью ряда промышленных процессов, чтобы лишить его любого из его естественного горчичного тепла, чтобы создать более универсальный нейтральный продукт.)

Другое дело, что горчичное масло из-за высокого уровня эруковой кислоты было запрещено продавать в Америке для употребления в пищу. Горчичное масло было разрешено продавать только для использования в качестве лечебного массажного масла, поэтому бутылки в индийских продуктовых магазинах имеют маркировку «Только для наружного использования». Но безопасность употребления эруковой кислоты все еще под вопросом.Большинство данных по эруковой кислоте получено в результате исследований на животных, а информация об исследованиях на людях основана на экспериментах на клеточных культурах и эпидемиологических исследованиях питания популяций, которые дают противоречивые результаты. Насколько мне известно и из того, что я читал, существуют явные различия в том, как разные животные реагируют на эруковую кислоту и метаболизируют ее.

Стоит ли готовить с горчичным маслом?

Честно говоря, вам решать, использовать ли это. Но, к счастью, появилась новая опция.Несколько лет назад я наткнулся на первое и единственное пищевое горчичное масло, одобренное Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов, под названием Yandilla, которое вы можете купить в Интернете. Произведенное в Австралии, это масло извлекается из семян горчичного растения, выведенного специально для уменьшения количества содержащейся в нем эруковой кислоты, при этом сохраняя при этом эфирный аромат горчичного масла – качественному маслу канолы с нейтральным вкусом не хватает.

По сравнению с другими горчичными маслами, доступными в индийских продуктовых магазинах, яндилла намного светлее по цвету и вязкости, но при этом обладает такой же степенью вкуса васаби.Со своей стороны, как и другие знакомые мне индийцы, у меня нет проблем с использованием горчичного масла, не одобренного FDA, всякий раз, когда я хочу получить его острый аромат или повторить один из аахаров моего отца, но если вас беспокоит потенциальные опасности проглатывания эруковой кислоты, вам следует попробовать Yandilla.

Наука о вкусе горчичного масла

Причина, по которой яндила с относительно низким содержанием эруковой кислоты по вкусу очень похожа на другие горчичные масла, заключается в том, что уникально острый характер горчичного масла происходит от совершенно не связанной молекулы: синигрина.

Когда семена черной и коричневой горчицы измельчаются, синигрин превращается ферментом под названием мирозиназа в аллилизотиоцианат ***, ту же молекулу, которая придает хрену и васаби их огненную природу.

*** Семена белой (желтой) горчицы редко используются для производства масел, поскольку при их измельчении образуется гораздо менее острая молекула, известная как п-гидроксибензилизотиоцианат.

Аллилизотиоцианат растворим в жире и чрезвычайно летуч; Если вы сильно вдохнете горчичное масло, вы сразу же почувствуете жжение, вызванное аллилизотиоцианатом внутри носа.Это ощущение вызвано чувствительностью слизистых оболочек, называемой хеместезисом, которая запускается связыванием аллилизотиоцианата с определенными сенсорными рецепторами, которые обнаруживают боль и воспаление (это явление отвечает за другие, похожие ощущения жжения, возникающие при употреблении любого из овощей из овощей. семейство brassica, включая хрен и васаби.)

Как использовать горчичное масло

Как я сказал выше, его можно использовать разными способами: жарить, тушить или добавлять в смесь для аахара.

Если вы хотите, чтобы его острый толчок был особенно мощным, вам нужно нагреть масло, что увеличивает летучесть его мощных ароматических молекул, отправляя их в воздух и вверх по носовым ходам. Например, чтобы подбодрить raita , я обжариваю специи в горячем горчичном масле и сбрызгиваю его сверху. Просто обратите внимание, что, хотя нагревание масла дает вам больший аромат, он также приводит к немного менее острому горчичному маслу на небе, именно потому, что вы вытеснили некоторые из этих молекул из масла в воздух.

В конце концов, о горчичном масле лучше всего думать как о любом другом ароматном масле, таком как оливковое масло, кунжутное масло или масло грецкого ореха. Я поливаю им салаты, как в рецепте салата из огурцов, который я разработал для этой статьи, и использую его в качестве финишного масла для многих блюд, независимо от того, сосредоточены ли они на овощах, рыбе, птице или стейке – практически везде, где я думаю, что это васаби. как край будет сиять.

границ | Интраколоническое горчичное масло вызывает висцеральную боль у мышей с помощью TRPA1-зависимых и независимых механизмов: роль повреждения тканей и рецепторов P2X

Введение

Висцеральная боль очень часто встречается в клинической практике, и это основная причина обращения за медицинской помощью ( Drewes et al., 2020). Катионный канал TRPA1 (временный рецепторный потенциал анкирина 1) был предложен в качестве потенциальной мишени для лечения этого конкретного типа боли (например, Lapointe and Altier, 2011). Горчичное масло (аллилизотиоцианат) является острым компонентом горчицы, хрена и васаби (Bandell et al., 2004). Было показано, что горчичное масло, а также другие электрофильные химические вещества (например, формалин) могут напрямую активировать TRPA1 (Jordt et al., 2004; Macpherson et al., 2007; McNamara et al., 2007), который локализован в субнаборе ноцицепторов, экспрессирующих TRPV1 (Story et al., 2003). Когда горчичное масло вводится в толстую кишку грызунов, оно вызывает ноцицептивные реакции сразу после этого из-за прямой активации ноцицепторов, упомянутых выше, и за этими реакциями следует механическая гипералгезия, относящаяся к брюшной стенке (Laird et al., 2001). Этот последний процесс является результатом центральной сенсибилизации (Urban and Gebhart, 1999), о чем может свидетельствовать фосфорилирование (активация) регулируемых внеклеточными сигналами киназ (ERK1 / 2) в спинном мозге (Gao and Ji, 2009).Кроме того, активация нейронов, экспрессирующих TRPA1, горчичным маслом приводит к нейрогенному воспалению, которое способствует экстравазации плазмы и отеку, что способствует возникновению боли (Matsuda et al., 2019).

Стоит отметить, что не все эффекты горчичного масла имеют нейронное происхождение, поскольку было показано, что этот химический раздражитель способен повреждать слизистую оболочку толстой кишки даже после денервации (Laird et al., 2000). Кроме того, хотя введение низких доз этого альгогенного химического вещества в соматическую ткань активирует исключительно TRPA1, высокие дозы могут надежно активировать другие подмножества ноцицептивных нейронов, помимо ноцицепторов, экспрессирующих TRPA1 (Braz and Basbaum, 2010).Эти TRPA1-независимые эффекты высоких доз горчичного масла могут быть связаны с повреждением тканей и высвобождением прогальгетических медиаторов поврежденными клетками, а не с непосредственным воздействием нейронов. Следовательно, высокие дозы горчичного масла могут быть полезны для изучения боли, вызванной повреждением тканей. АТФ действует на нейрональные рецепторы P2X и, как известно, является одним из основных альгогенных химических веществ, выделяемых при повреждении клеток (Cook and McCleskey, 2002). Фактически, пуринергический антагонизм был предложен как многообещающий терапевтический инструмент для облегчения боли при воспалительных заболеваниях кишечника, таких как болезнь Крона и язвенный колит (Burnstock, 2017), которые характеризуются макроскопическими поражениями толстой кишки, которые, несомненно, способствуют возникновению боли (Gecse and Vermeire, 2018).Однако, насколько нам известно, вклад TRPA1 (прямая активация нейронов) и рецепторов P2X (АТФ из поврежденной ткани) в висцеральную боль, вызванную горчичным маслом, никогда не изучался.

Принимая во внимание эти антецеденты, мы стремились изучить вклад TRPA1 и пуринергических рецепторов в ноцицептивные ответы и отраженную гипералгезию, вызванную низкими и высокими дозами горчичного масла внутри толстой кишки. Сначала мы проверили, может ли лечение резинифератоксином, лекарством, способным избирательно удалять TRPV1-экспрессирующие нейроны (Montilla-García et al., 2018) (который, как описано выше, содержит ноцицепторы TRPA1 +), изменяет поведенческие проявления, гистологические изменения в толстой кишке (такие как появление нейрогенного отека и явное повреждение ткани) и активацию нейронов в спинном мозге (измеряется как фосфорилирование ERK). ), индуцированные внутрикостным горчичным маслом. Во-вторых, мы протестировали эффекты пуринергического антагониста TNP-ATP (Honore et al., 2002) на изменения поведения, вызванные низкими и высокими дозами горчичного масла, и сравнили их с эффектами, вызванными фармакологическим антагонизмом TRPA1 AP18 ( Цубота-Мацунами и др., 2012).

Методы

Экспериментальные животные

Экспериментальными животными были взрослые самки мышей CD-1 (Charles River, Барселона, Испания) массой 25–30 г. Животные были акклиматизированы в наших помещениях для животных в течение как минимум 1 недели перед тестированием и содержались в клетках для колоний (1145T Tecniplast, Varese, Италия) с древесным гранулятом тополя в качестве подстилки (Safe, Augy, Франция) при температуре и освещении. контролируемые помещения (22 ± 1 ° C, свет в 08.00 ч, выключение в 20.00, замена воздуха каждые 20 мин).Стандартная лабораторная диета (диета Harlan Teklad Research, Мэдисон, Висконсин, США) и водопроводная вода были доступны ad libitum до начала экспериментов. Тестирование проводилось во время световой фазы (с 9.00 до 15.00 ч) и в произвольное время в течение эстрального цикла. С мышами обращались в соответствии с международными стандартами (директива Совета европейских сообществ 2010/63), а процедуры были одобрены Комитетом по этике исследований Университета Гранады. Чтобы уменьшить количество животных в этом исследовании, мы использовали тех же мышей для поведенческих исследований, гистологического анализа и иммуноокрашивания, когда это возможно.

Лекарства и администрация лекарственных средств

Мы оценили эффекты селективного антагониста TRPA1 AP18 (4- (4-хлорфенил) -3-метилбут-3-ен-2-оксим) и пуринергического антагониста TNP-ATP (2 ‘, Тетранатриевая соль 3′-O- (2,4,6-тринитрофенил) аденозин-5’-трифосфата) (обе поставляются Sigma-Aldrich, Барселона, Испания) при ноцицептивном поведении, вызванном горчичным маслом, и отнесенной гипералгезии. AP18 растворяли в 7,5% ДМСО с 0,5% Твина 80 и доводили до 100% объема с помощью PBS. TNP-ATP растворяли в физиологическом растворе.AP18 (10 мг / кг) или TNP-ATP (25 мкг / кг) или их растворители вводили внутрибрюшинно в объеме 10 мл / кг за 30 и 5 минут до внутрикостного введения горчичного масла, соответственно, как эти Сообщается, что лекарства проявляли активность при введении этим путем в это время до использования химического альгогена (Xu et al., 2008; Tsubota-Matsunami et al., 2012). Растворы лекарств готовили непосредственно перед началом экспериментов.

Оценка ноцицептивного поведения и отнесенной гипералгезии, вызванной интраколоническим горчичным маслом

Доза горчичного масла, вводимая для оценки висцеральной боли у мышей, значительно варьируется между исследованиями и обычно колеблется от 0.От 5% до 2,5% (Laird et al., 2001; Li et al., 2013; Sałaga et al., 2015; Zielińska et al., 2015). Поэтому мы выбрали дозы 0,5 и 2,5% горчичного масла в качестве низких и высоких доз для сравнения в большинстве описанных здесь экспериментов. Мышей содержали в отдельных прозрачных пластиковых коробках (7 × 7 × 13 см) на приподнятой платформе с полом из проволочной сетки, а небольшие зеркала позади и под камерами облегчили наблюдение за поведением животных. После 40-минутного периода привыкания животных удаляли из отсеков, а после нанесения вазелина на перианальную область, чтобы избежать стимуляции соматических областей, 50 мкл раствора горчичного масла (Sigma-Aldrich) (от 0.От 5 до 2,5%), растворенного в PEG 400 (Bourgeois et al., 2014), закапывали в толстую кишку через задний проход через тонкую канюлю с закругленным концом (внешний диаметр 0,61 мм; длина 4 см), подключенную к 1710 TLL. Микрошприц Hamilton (Teknokroma, Барселона, Испания). Контрольным животным такой же объем носителя горчичного масла вводили внутриклеточно. После закапывания животных немедленно возвращали в отсек, где количество ноцицептивных поведений (облизывание, растяжение и сокращение живота) подсчитывалось в течение 20 минут, разделенных на четыре периода по 5 минут каждый (Laird et al., 2001; Гонсалес-Кано и др., 2013).

После оценки поведения, связанного с болью, описанного выше, наличие отраженной гипералгезии определяли путем тестирования количества реакций отмены на точечную механическую стимуляцию живота. Нить фон Фрея (Touch-Test Sensory Evaluators, North Coast Medical Inc., Гилрой, Калифорния, США), откалиброванная до 0,16 г (3,22 мН), накладывалась на нижнюю / среднюю часть живота, избегая перианальных и внешних областей гениталий. Нить накладывали 10 раз по 2 с каждый с интервалами между нанесениями не менее 5 с, и подсчитывали количество положительных откликов из 10 применений.Реакция на нить считалась положительной, если наблюдались немедленное лизание или царапание места нанесения, резкое втягивание живота или прыжки.

Экспериментатор, который оценивал поведенческие реакции, не знал, как лечить экспериментальных животных. Каждое животное использовалось только один раз и получало разовую концентрацию горчичного масла или его носителя и разовую дозу одного лекарства или его растворителя.

Оценка ноцицептивных ответов, вызванных интраплантарной инъекцией формалина или горчичного масла

Ноцицептивные ответы, вызванные внутриподошвенным введением химических раздражителей, оценивали, как описано ранее (Shields et al., 2010), с небольшими изменениями. Вкратце, 20 мкл низкой дозы (0,5%) разбавленного формалина (Sigma-Aldrich), растворенного в физиологическом растворе, или горчичном масле, приготовленном, как описано в предыдущем разделе, вводили интраплантарно в дорсальную поверхность правой задней лапы с помощью Микрошприц 1710 TLL Hamilton (Teknokroma) и игла 30 1/2 калибра. Сразу после инъекции животное помещали в стеклянный цилиндр для наблюдения. Контрольным животным тот же объем носителя, который использовался для формалина или горчичного масла, вводили внутриподошвенно.Время, потраченное на облизывание или укусы инъекционной лапы, регистрировалось в течение 10 минут сразу после инъекции.

Мы использовали резинифератоксин (RTX, Tocris Cookson Ltd., Бристоль, Соединенное Королевство) в качестве «молекулярного скальпеля» для избирательной абляции нейронов, экспрессирующих TRPV1. После индукции анестезии изофлураном (IsoVet®, B. Braun, Барселона, Испания) каждое животное получало однократную дозу RTX (50 мкг / кг), растворенного в 10% Tween 80 и 10% этаноле в физиологическом растворе (0.9% NaCl) внутрибрюшинно (Montilla-García et al., 2017). Животные контрольной группы получали равный объем носителя. После внутрибрюшинной инъекции мышей помещали в их домашние клетки на следующие 5 дней, после чего проводили поведенческое тестирование или сбор образцов.

Определение

РНК были извлечены из 12 ганглиев дорсальных корешков L6 (DRG), объединенных от шести разных животных. Полную РНК выделяли на среде фенол / хлороформ с использованием реагента Trizol (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) и осаждения этанолом в соответствии с инструкциями Института Сэнгера ^© (ftp: // ftp.sanger.ac.uk/pub/resources/mouse/sigtr/RTPCR.pdf). Концентрацию и качество РНК оценивали спектрофотометрически с помощью прибора NanoDrop ND-1000 и электрофоретически с окрашиванием бромидом этидия.

кДНК первой цепи синтезировали с использованием 1 мкг каждого образца РНК в реакционном объеме 20 мкл, содержащем 5 мМ MgCl ₂ , 1 × буфер RT, 1 мМ dNTP, 1 ед. / Мкл ингибитора РНКазы, 2,5 мкМ олиго ( dT) 16 и обратная транскриптаза MuLV 2,5 Ед / мкл (Applied Biosystems, Мадрид, Испания). Смесь инкубировали при 42 ° C в течение 15 мин и при 99 ° C в течение 5 мин.

Относительную количественную оценку уровней мРНК TrpA1 и TrpV1 в мышиных DRG проводили с помощью ПЦР в реальном времени. Праймеры, охватываемые интронами, были разработаны для амплификации TrpA1 и TrpV1 , а мышиный β-актин был использован для нормализации общего количества мРНК. Последовательности праймеров, размеры продуктов ПЦР и номера доступа в GenBank для каждого гена приведены в таблице 1. Реакции ПЦР были установлены путем объединения разведенной кДНК (5 мкл) в качестве матрицы с 0.Конечная концентрация каждой пары праймеров 5 мкМ и 12,5 мкл 2 × SYBR Green PCR Master Mix (Promega, Мадрид, Испания) и доводили до конечного объема 25 мкл стерильной водой, свободной от нуклеаз (Bio-Rad, Hercules , Калифорния, США). Образцы первоначально денатурировали при 94 ° C в течение 2 минут, затем следовали 40 циклов по 30 с для денатурации при 94 ° C, 30 с отжига при 60 ° C и 30 с для удлинения при 72 ° C на Techne Quantica ™ Real. -временная ПЦР-система. Анализ кривой плавления использовали для проверки специфичности амплификации.Все реакции проводили в трех экземплярах с контролями без матрицы. При каждом условии использовали три независимых биологических повтора.

ТАБЛИЦА 1 . Последовательности праймеров (5′-3 ‘) и размеры продуктов ПЦР.

Гистология

После того, как была вызвана глубокая анестезия изофлураном, мышам внутрисердечно перфузировали 20 мл физиологического раствора, а затем 4% раствор параформальдегида (Scharlab, Барселона, Испания). Толстую кишку удалили и зафиксировали в 4% параформальдегиде в течение 2 часов при 4 ° C.Образцы обезвоживали и заключали в парафиновые блоки. Срезы депарафинизировали ксилолом и регидратировали перед тем, как срезы ткани (5 мкм) окрашивали гематоксилин-эозином (Panreac, Castellar del Vallès, Испания). Морфометрический анализ каждого окрашенного среза был выполнен с помощью программного обеспечения ImageJ (версия 1.48, Wayne Rasband, NIH, Bethesda, MD, США), а площадь подслизистой оболочки (расположенная между собственной пластинкой и мышечной оболочкой) была измерена и нормализована по отношению к общая площадь отдела толстой кишки как показатель отека.Изображения были получены с помощью микроскопа Nikon Eclipse 50i, оснащенного камерой DS-Ri1 (Nikon Instruments Europe BV, Амстердам, Нидерланды), с увеличением 4 × и 10 ×.

Иммуногистохимия

Мышей перфузировали транскардиально, как описано выше, и собирали L6 DRG и соответствующий сегмент спинного мозга L3. Ткани подвергали последующей фиксации, дегидратировали и заливали парафином, как описано выше, перед иммуноокрашиванием.

Иммуноокрашивание TRPV1 и NeuN проводили в L6 DRG, где расположено большинство колоректальных афферентов (Robinson et al., 2004; Guo et al., 2019). После депарафинизации срезы тканей инкубировали с блокирующим раствором (5% нормальная ослиная сыворотка, 0,3% Triton X-100 в TBS) в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем срезы инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с козьим антителом против TRPV1 (sc-12498, 1: 100, Santa Cruz Biotechnology, Гейдельберг, Германия) в блокирующем растворе. После инкубации срезы промывали три раза по 10 минут каждый и инкубировали в течение 1 часа со вторичным ослиным антителом против козла Alexa Fluor-488 (A-11055, 1: 500; Invitrogen) и конъюгированным мышиным антителом против NeuN. (MAB377A5, 1: 500, Merck Millipore, Мадрид, Испания).Затем срезы промывали три раза по 10 мин каждый и закрепляли с помощью ProLong® Gold Antifade Mountant (Life Technologies, Alcobendas, Испания). Изображения получали с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа (модель A1, Nikon Instruments Europe BV).

Срезы ткани из сегмента спинного мозга L3 обрабатывали для извлечения антигена путем нагревания паром в 0,01 М цитратном буфере, pH 6,0, в течение 20 мин. Активность эндогенной пероксидазы гасили 3% H ₂ O ₂ в метаноле, pH 7.4, на 15 мин. Затем срезы промывали TBS с 0,1% Tween 20 и инкубировали в блокирующем растворе (2,5% кроличья сыворотка) в течение 20 минут. После этого следовала инкубация с первичным антителом против киназ, регулируемых фосфо-внеклеточным сигналом (pERK1 / 2) (4370S, 1: 200; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, США) в инкубационной камере при комнатной температуре в течение 60 мин. . Набор для обнаружения полимеров ImmPRESS ^® HRP Anti-Rabbit IgG (пероксидаза) (MP-7401, Vector Laboratories, Burlingame, CA, США) использовали в соответствии с инструкциями производителя, и иммунореакцию визуализировали с помощью пероксидазы ImmPACT ™ DAB. (HRP) субстрат (SK-4105, Vector Laboratories) в течение 20 с.

Статистический анализ

Когда сравнивали несколько средних, в зависимости от эксперимента использовали односторонний или двусторонний дисперсионный анализ (ANOVA) с последующим апостериорным тестом Бонферрони. При сравнении двух средних значений использовался непарный тест Стьюдента t . Данные qPCR в реальном времени анализировали с помощью статистики теста Стьюдента t и сравнительного метода Ct (метод 2-∆∆Ct) (Livak and Schmittgen, 2001). Исходные данные Ct были нормализованы относительно экспрессии β-актина.Во всех сравнениях различия между значениями считались значимыми, когда значение p было ниже 0,05. Все статистические анализы были выполнены с помощью программы SigmaPlot 12.0 (Systat Software Inc., Сан-Хосе, Калифорния).

Результаты

Ноцицептивные ответы и соответствующая гипералгезия, вызванная различными дозами интраколонического горчичного масла

Животные, получавшие интраколоническое лечение носителем горчичного масла, почти не показали поддающихся измерению болевых реакций (например, лизание, растяжение или сокращение живота) во время весь период наблюдения (20 мин) (рис. 1А).Внутриколонное введение горчичного масла в любой из трех испытанных доз (0,5, 1,0 или 2,5%) вызывало поведение, связанное с болью, которое было максимальным в период сразу после введения (0–5 мин) (рис. 1А). Хотя количество ноцицептивных форм поведения, вызванных каждой из трех доз, не различается заметно в течение первых 5 минут после применения, продолжительность ноцицептивного ответа зависела от дозы. При использовании химического раздражителя в концентрации 0,5% поведенческие реакции быстро уменьшались через 5 мин и почти полностью исчезали через 15–20 мин.Однако, когда использовалась концентрация горчичного масла 2,5%, ноцицептивные ответы сохранялись лишь с небольшим уменьшением в течение 20-минутного периода наблюдения. Доза горчичного масла 1,0% показала промежуточную картину: ноцицептивное поведение уменьшалось в течение первых 5–10 минут, а затем оставалось стабильным в течение оставшихся 10 минут (рис. 1А).

РИСУНОК 1 . Ноцицептивное поведение и отраженная гипералгезия, вызванная различными дозами горчичного масла в толстой кишке. (A) Динамика ноцицептивного поведения у мышей в течение 20 минут после внутриполостного введения горчичного масла (MO, 0.5, 1,0 или 2,5%) или его носителя, измеренные за 5-минутные периоды. (B) Ноцицептивное поведение в течение всего периода наблюдения (0–20 мин) после введения MO или его носителя у мышей из экспериментальных групп, показанных в (A) . (C) Ответы на механическую стимуляцию 0,16 г нитью фон Фрея в брюшной стенке мышей через 20 минут после закапывания MO или его носителя. (A – C) Каждая точка и вертикальная линия представляют собой среднее ± SEM значений, полученных у 8-10 мышей на группу.Статистически значимые различия между значениями у мышей, получавших MO или его носитель: p <0,05, p <0,01; двусторонний (A) или односторонний (B и C) ANOVA с последующим тестом Бонферрони.

Дозовая зависимость поведенческих эффектов, вызванных горчичным маслом, стала более очевидной, когда мы суммировали общее количество болевых реакций в течение 20-минутного периода оценки после применения химического раздражителя (рис. 1B).

Мы также оценили гипералгезию брюшной стенки для точечной механической стимуляции после инстилляции горчичного масла. Животные, которым вводили химический альгоген-носитель, реагировали только в 10% случаев при стимуляции тонкой (0,16 г) нитью фон Фрея (рис. 1С). После закапывания 0,5% горчичного масла животные показали усиленные ответы в тесте фон Фрея, отвечая на 55 ± 5% стимуляции (рис. 1C). Сенсибилизация к механической стимуляции была еще более очевидной в тестах с 1.0 или 2,5% горчичного масла, демонстрируя четкую дозовую зависимость с ответами на 88 ± 3,74% стимуляций в группе, получавшей горчичное масло в концентрации 2,5% (рис. 1C).

Мы выбрали 0,5 и 2,5% горчичного масла как низкую и высокую дозу, соответственно, для последующих экспериментов.

Дифференциальные эффекты удаления нейронов, экспрессирующих TRPV1, на ноцицептивное поведение и указанную гипералгезию, вызванную низкими и высокими дозами горчичного масла

Сначала мы провели двойное иммуноокрашивание в L6 DRG, чтобы пометить пан-нейрональные маркеры NeuN и TRPV1 в ткани. образцы от мышей, обработанных RTX или его растворителем.Хотя было обнаружено, что NeuN экспрессируется в сомах всех нейронов DRG, TRPV1 был мечен только в некоторых небольших нейронах у контрольных мышей, обработанных растворителем RTX (рис. 2A, верхние панели). У животных, получавших RTX, мы не обнаружили заметного окрашивания TRPV1, хотя метка NeuN все еще присутствовала (рис. 2A, нижние панели), что позволяет предположить, что абляция нейронов была ограничена популяцией TRPV1 +. Идентичные результаты были обнаружены в L4 DRG (данные не показаны). Как и ожидалось, и в результате удаления нейронов, экспрессирующих TRPV1, мРНК TrpV1 в L6 DRG была явно снижена (рис. 2В).Кроме того, мРНК для TrpA1 также была заметно снижена у животных, получавших RTX, в той же степени, что и транскрипты TrpV1 (рис. 2В). Эти результаты предполагают, что нейроны TRPA1 + являются частью популяции нейронов, экспрессирующих TRPV1.

РИСУНОК 2 . Резинифератоксин уничтожает большинство нейронов, экспрессирующих TRPV1. (A) Двойное мечение NeuN (красный) и TRPV1 (зеленый) в ганглии заднего корешка L6 (DRG). Верхние панели: образцы от контрольных (обработанных физиологическим раствором) мышей.Нижние панели: образцы мышей, обработанных резинифератоксином (RTX). Масштабная линейка 100 мм. (B) Относительная количественная оценка уровней мРНК TrpA1 и TrpV1 с помощью ПЦР в реальном времени в L6 DRG от мышей, получавших RTX или физиологический раствор. Статистически значимые различия между значениями у мышей, получавших RTX или физиологический раствор: ** p <0,01 (двухфакторный дисперсионный анализ с последующим тестом Бонферрони).

Сообщалось, что ноцицептивные эффекты низких доз формалина и горчичного масла, вводимых интраплантарно, были отменены у мышей с нокаутом TRPA1 (Braz and Basbaum, 2010).Поэтому, чтобы проверить, приводит ли RTX-индуцированная абляция TRPV1-экспрессирующих нейронов к функциональному подавлению активности TRPA1, мы оценили ноцицептивные ответы, вызванные внутриподошвенной инъекцией низкой дозы (0,5%) формалина или горчичного масла у животных, получавших растворитель. или RTX. И формалин, и горчичное масло вызывали сильное облизывание / кусание инъецированной задней лапы у контрольных животных, тогда как ответы были заметно снижены у мышей, получавших RTX (дополнительные рисунки S1A, B). Таким образом, в наших экспериментальных условиях лечение RTX вызывало значительное удаление нейронов, экспрессирующих TRPV1, и сопутствующее снижение транскрипции TrpA1, что сопровождалось уменьшением болевых реакций, вызванных известными активаторами TRPA1, введенными в соматическую ткань.

Затем мы исследовали влияние RTX-индуцированной абляции TRPV1-экспрессирующих нейронов как на ноцицептивное поведение, так и на гипералгезию брюшной стенки, вызванную низкой (0,5%) и высокой дозой (2,5%) горчичного масла в толстой кишке. Лечение RTX почти полностью устраняло ноцицептивное поведение, вызванное низкой дозой внутрикостного горчичного масла, как во время пика болевых реакций в течение первых 5 минут после введения горчичного масла, так и в последующие 5-минутные интервалы в течение 20-минутного периода оценки (рис. 3А).Когда мы тестировали высокую дозу горчичного масла (2,5%), мы обнаружили значительное, хотя и частичное снижение начальных ноцицептивных ответов в течение 5-минутного периода сразу после введения химического раздражителя, но после этого начального снижения болевые реакции в RTX у животных, получавших лечение, увеличилось до значений, близких к значениям, наблюдаемым у животных, получавших растворитель RTX, в течение всех последующих 5-минутных периодов в течение 20-минутного периода оценки (Рисунок 3B).

РИСУНОК 3 .Дифференциальные эффекты удаления нейронов, экспрессирующих TRPV1, на ноцицептивное поведение, вызванное внутрикостным введением низкой и высокой доз горчичного масла. Влияние обработки резинифератоксином (RTX) или его растворителем (физиологический раствор) на динамику ноцицептивного поведения у мышей в течение 20 минут (измеренных за периоды 5 минут) после внутрикостного введения горчичного масла (MO) 0,5% (A) и 2,5% (B) или его носитель (C) Ноцицептивное поведение в первые 5 мин (0–5) и в следующие 15 мин (5–20) после введения МО или его носителя в мыши из экспериментальных групп, представленных в (A) и (B) . (A – C) Каждая точка или столбик и вертикальная линия представляют собой среднее ± SEM значений, полученных у 8–10 мышей на группу. Статистически значимые различия между значениями у мышей, получавших MO или его носитель: * p <0,05, ** p <0,01; и между значениями, полученными у мышей, получавших MO и физиологический раствор или RTX: # p <0,05, ## p <0,01 (двухфакторный дисперсионный анализ с последующим тестом Бонферрони).

Чтобы облегчить сравнение эффекта абляции TRPV1 + нейрона на ноцицептивные ответы, вызванные обеими дозами внутрикостного горчичного масла в начальный период после введения химического раздражителя и в более длительные моменты времени, мы сгруппировали болевые реакции в течение 5 Период –20 мин после каждой дозы горчичного масла отдельно от первоначальной записи в течение первых 0–5 мин.Этот анализ ясно показал полное ингибирование RTX ноцицептивных ответов, вызванных 0,5% горчичным маслом, как непосредственно, так и в более длительные периоды после введения химического раздражителя, и что при использовании 2,5% горчичного масла RTX только частично обращал ноцицептивные ответы во время начальный 5-минутный период и не имел эффекта в течение оставшихся 5-20 минут (рис. 3C).

Когда мы тестировали механическую гипералгезию брюшной стенки, вызванную низкими и высокими дозами горчичного масла у животных, получавших RTX или его растворитель, мы обнаружили, что удаление нейрона TRPV1 приводило к полной реверсии тактильной гиперчувствительности в 0.Группа 5% горчичного масла, но не оказала никакого эффекта в группе дозы 2,5% (Рисунок 4).

РИСУНОК 4 . Дифференциальные эффекты удаления нейронов, экспрессирующих TRPV1, на отраженную гипералгезию, индуцированную внутрикостным введением низкой и высокой доз горчичного масла. Ответы на механическую стимуляцию 0,16-граммовой нитью фон Фрея в брюшной стенке мышей, получавших резинифератоксин (RTX) или его растворитель (физиологический раствор), через 20 минут после инстилляции MO (0,5 и 2,5%) или его носителя.Каждая полоса и вертикальная линия представляют собой среднее ± SEM значений, полученных у 8-10 мышей на группу. Статистически значимые различия между значениями у мышей, получавших MO или его носитель: ** p <0,01; и между значениями, полученными у мышей, получавших MO и физиологический раствор или RTX: ## p <0,01 (двухфакторный дисперсионный анализ с последующим тестом Бонферрони).

Следовательно, TRPV1 + нейроны (которые экспрессируют TRPA1), по-видимому, необходимы как для болеоподобного поведения, так и для отраженной гипералгезии, индуцированной интра-толстым 0.5% горчичного масла, тогда как их роль, по-видимому, ограничена в ноцицептивных реакциях, вызванных 2,5% горчичного масла, и, по-видимому, не участвуют в тактильной гиперчувствительности, вызванной этой высокой дозой химического раздражителя.

Роль TRPV1-экспрессирующих нейронов в гистологических изменениях в толстой кишке после введения низких и высоких доз горчичного масла

Чтобы определить, вызывает ли горчичное масло наблюдаемые изменения в толстой кишке, которые могут объяснить описанные нейрононезависимые от TRPV1 болевые реакции В предыдущем разделе мы провели гистологические исследования на животных, получавших RTX или его растворитель.

Внутри ободочное введение 0,5% горчичного масла не вызывало явных гистологических изменений, и мы наблюдали только легкий (незначительный) отек по сравнению с образцами от мышей, получавших носитель, измеренный как увеличение площади подслизистой оболочки по отношению к общей площади. отдела толстой кишки. Процент площади подслизистой оболочки составлял 13,41 ± 2,01% у животных, получавших носитель, и 18,14 ± 4,52% у животных, получавших низкую дозу горчичного масла ( p > 0,05). Однако 2.5% горчичное масло вызывало заметные гистологические изменения, включая выраженный отек (рис. 5A, верхние левые панели; рис. 5B), а также серьезное повреждение тканей, о чем свидетельствует потеря эпителия и повреждение крипт (рис. 5A, нижние левые панели). Обработка RTX не вызвала очевидных изменений внешнего вида срезов толстой кишки у мышей, получавших носитель горчичного масла (рис. 5A, верхние правые панели), но полностью ослабила отек, вызванный 2,5% этого химического раздражителя (рис. 5A, верхние правые панели). ; Рисунок 5B).Интересно, что повреждение эпителия и крипт все еще присутствовало у животных, получавших 2,5% горчичное масло, несмотря на удаление TRPV1 с помощью RTX (рис. 5A, нижние правые панели).

РИСУНОК 5 . Нейроны, экспрессирующие TRPV1, влияют на отек, но не на повреждение тканей после интра-толстого введения высокой дозы горчичного масла. (A) Вверху: микрофотографии репрезентативных срезов толстой кишки, окрашенных гематоксилином-эозином, у мышей, которым давали горчичное масло (MO) 2,5% или его носитель и лечили резинифератоксином (RTX) или его растворителем (физиологический раствор).Масштабная линейка 250 мкм. Внизу: детали эпителия в заштрихованных областях на верхних панелях. Шкала 100 мкм. (B) Количественная оценка подслизистой оболочки относительно общей площади сечения толстой кишки (как показатель отека) у мышей, получавших MO или его носитель и обработанных RTX или физиологическим раствором. Каждая полоса и вертикальная линия представляют собой среднее значение ± SEM значений, полученных у четырех-шести мышей на группу. Статистически значимые различия между значениями у мышей, получавших MO или его носитель: * p <0.05; и между значениями, полученными у мышей, получавших MO и физиологический раствор или RTX: # p <0,05 (двухфакторный дисперсионный анализ с последующим тестом Бонферрони).

Таким образом, наши результаты предполагают, что, хотя отек, вызванный интраокольным введением высокой дозы горчичного масла, полностью зависел от присутствия TRPV1-экспрессирующих нейронов, повреждение эпителия толстой кишки, по-видимому, опосредовано механизмами, независимыми от этой популяции нейронов. .

Вклад нейронов, экспрессирующих TRPV1, в активацию нейронов (pERK) в спинном мозге после введения высокой дозы горчичного масла

Мы проверили, стимулируется ли стимуляция толстой кишки 2.5% горчичное масло индуцировало активацию (фосфорилирование) ERK1 / 2 в спинном мозге L3 (иннервируемом нейронами L6 DRG) в качестве суррогатной меры активации ноцицептивных нейронов и зависимости этого процесса от RTX-чувствительных нейронов. Поскольку как поверхностные пластинки спинного рога спинного мозга, так и нейроны пластинки X вовлечены в висцеральную боль (Traub and Murphy, 2002), мы провели эти исследования в обеих областях.

Мы не обнаружили заметного окрашивания pERK1 / 2 в спинном мозге мышей, получавших физиологический раствор или RTX (в отсутствие горчичного масла), в поверхностном дорсальном роге или в области, окружающей центральный канал (пластинка X).На рисунках 6A, B (левые панели) представлены репрезентативные изображения, а на рисунке 6C показаны количественные данные для количества клеток pERK1 / 2 +. Напротив, значительное увеличение количества клеток pERK1 / 2 + было отмечено в этих областях в образцах от мышей, получавших 2,5% горчичного масла интраколонически (Фигуры 6A – C). Обработка RTX заметно снизила окрашивание pERK1 / 2 в образцах от мышей, получавших 2,5% горчичного масла, но только в поверхностном дорсальном роге, без влияния на мечение pERK1 / 2 в пластинке X, где мечение оставалось повышенным, несмотря на устранение TRPV1-экспрессии нейроны (Рисунки 6A – C).

РИСУНОК 6 . Экспрессия pERK1 / 2 в спинном мозге после интра-толстого введения высокой дозы горчичного масла лишь частично зависит от нейронов, экспрессирующих TRPV1. (A) Репрезентативные микрофотографии иммуноокрашивания pERK1 / 2 в поверхностном дорсальном роге и (B) в области, окружающей центральный канал (пластинка X) спинного мозга L3 после интраполостного введения 2,5% горчичного масла (MO ) или его носитель в образцах от контрольных (обработанных физиологическим раствором) животных (верхние панели) и мышей, обработанных резинифератоксином (RTX, нижние панели).Шкала 100 мкм. (C) Количественная оценка количества клеток, экспрессирующих pERK1 / 2, в поверхностном дорсальном роге и пластинке X после внутрикостного введения 2,5% MO или его носителя в образцах от мышей, обработанных RTX или физиологическим раствором. Каждая полоса и вертикальная линия представляют собой среднее ± SEM значений, полученных у восьми животных. Статистически значимые различия между значениями у мышей, получавших MO или его носитель: ** p <0,01; и между значениями, полученными в поверхностном спинном роге у мышей, получавших MO и физиологический раствор или RTX: ## p <0.01 (двусторонний дисперсионный анализ с последующим тестом Бонферрони).

Таким образом, 2,5% горчичного масла вызывают заметную активацию ERK1 / 2 в областях спинного мозга, связанных с висцеральной болью. Нейроны, экспрессирующие TRPV1, по-видимому, участвуют в этой активации только в поверхностном дорсальном роге, тогда как активация pERK1 / 2 в пластинке X не зависит от этой популяции нейронов.

Влияние фармакологического антагонизма пуринорецепторов TRPA1 и P2X на ноцицептивные ответы и указанную гипералгезию, вызванную низкими и высокими дозами горчичного масла

Учитывая, что 2.5% горчичное масло (но не низкая 0,5% доза) вызывало значительное повреждение эпителия толстой кишки, мы предположили, что не зависящие от нейронов TRPV1 поведенческие реакции, которые мы наблюдали с высокой дозой горчичного масла, могут быть связаны с веществами, выделяемыми при повреждении тканей. Поскольку АТФ является одним из канонических химических альгогенов, высвобождаемых во внеклеточную среду после гибели клеток (Cervero et al., 1993), мы изучили влияние антагониста P2X TNP-ATP на ноцицептивное поведение и отразили гипералгезию у животных, получавших 0.5 и 2,5% горчичного масла, и сравнил его эффекты с эффектами антагонизма рецепторов TRPA1 со стороны AP18.

Введение растворителей AP18 или TNP-ATP не оказывало значительного влияния на болевое поведение, вызванное внутрикостным введением как низкой, так и высокой дозы горчичного масла (данные не показаны). AP18 полностью устранял ноцицептивное поведение, индуцированное низкой дозой интра-толстого горчичного масла в течение 20-минутного периода наблюдения (рис. 7A). Однако этот антагонист TRPA1 вызывал только частичное снижение начальных ноцицептивных ответов в течение 5-минутного периода сразу после введения высокой дозы горчичного масла, не влияя на ноцицептивные ответы в течение последующих 5-минутных периодов до конца 20-минутного периода. (Рисунок 7B).Эффекты TNP-ATP на висцеральную боль, вызванную горчичным маслом, показали картину, отличную от той, которую оказывает AP18. Антагонист P2X не изменял ноцицептивные ответы, вызванные 0,5% горчичным маслом, в любое время в течение периода наблюдения (фигура 7A). TNP-ATP также не смог изменить начальные болевые реакции в течение 5 минут сразу после введения 2,5% горчичного масла, но почти полностью исключил болевые реакции в более длительные моменты времени от 5 до 20 минут после введения химического раздражителя (рис. 7Б).

РИСУНОК 7 . Дифференциальные эффекты антагонизма TRPA1 и P2X на ноцицептивное поведение, вызванное внутрикостным введением низкой и высокой доз горчичного масла. Влияние внутрибрюшинного введения AP18 (10 мг / кг) или TNP-ATP (25 мкг / кг) на временную динамику ноцицептивного поведения мышей в течение 20 минут (измеряемых в течение 5-минутных периодов) после внутрикостного введения горчицы масло (MO) 0,5% (A) и 2,5% (B) или его носитель (C) Ноцицептивное поведение в первые 5 мин (0–5) и в последующие 15 мин (5–20 ) после введения MO или его носителя мышам из экспериментальных групп показали в (A) и (B) . (A – C) Каждая точка или столбик и вертикальная линия представляют собой среднее ± SEM значений, полученных у шести-восьми мышей на группу. Статистически значимые различия между значениями у мышей, получавших MO или его носитель: * p <0,05, ** p <0,01; и между значениями, полученными у мышей, получавших только MO или AP18 или TNP-ATP: # p <0,05, ## p <0,01 (двухфакторный дисперсионный анализ с последующим тестом Бонферрони).

Чтобы облегчить сравнение эффекта AP18 и TNP-ATP на ноцицептивные ответы, вызванные каждой дозой горчичного масла в начальный период после введения химического раздражителя и в более длительные моменты времени, мы сгруппировали болевые реакции в течение 5–20 минут после применения каждой дозы горчичного масла отдельно от первоначальных ответов в течение первых 0–5 минут (рис. 7C).Этот анализ ясно показал, что антагонизм TRPA1 обычно снижает ноцицептивные ответы, вызванные 0,5% горчичным маслом, тогда как при использовании высокой дозы химического раздражителя, по-видимому, участвуют дополнительные механизмы в ноцицептивных ответах, особенно через 5 минут после введения горчичного масла и после этого. . Принимая во внимание заметные ингибирующие эффекты TNP-ATP на поздние ноцицептивные ответы, вызванные 2,5% горчичным маслом, механизмы, лежащие в основе этих эффектов, по-видимому, включают участие рецепторов P2X.

Мы также протестировали механическую гипералгезию, вызванную низкой и высокой дозой горчичного масла, у животных, получавших АР18 и TNP-ATP. Мы обнаружили, что AP18 заметно изменил тактильную гиперчувствительность при использовании 0,5% горчичного масла, но показал минимальные (незначительные) эффекты у животных, получавших 2,5% дозу химического раздражителя (рис. 8). С другой стороны, TNP-ATP не смог обратить вспять упомянутую гипералгезию, вызванную 0,5% горчичным маслом, хотя это привело к значительному снижению тактильной гиперчувствительности, вызванной 2.5% этого химического раздражителя. Эти результаты снова указывают на различную роль рецепторов TRPA1 и P2X в боли, вызванной различными дозами тестируемого здесь горчичного масла.

РИСУНОК 8 . Дифференциальные эффекты антагонизма TRPA1 и P2X на отраженную гипералгезию, вызванную введением внутрь толстой кишки низкой и высокой доз горчичного масла. Ответы на механическую стимуляцию 0,16 г филамента фон Фрея в брюшной стенке мышей, получавших внутрибрюшинно AP18 (10 мг / кг) или TNP-ATP (25 мкг / кг), через 20 мин после инстилляции MO (0.5 и 2,5%) или его транспортное средство. Каждая полоса и вертикальная линия представляют собой среднее значение ± SEM значений, полученных у шести-восьми мышей на группу. Статистически значимые различия между значениями у мышей, получавших MO или его носитель: ** p <0,01; и между значениями, полученными у мышей, получавших только MO или AP18 или TNP-ATP: ## p <0,01 (двухфакторный дисперсионный анализ с последующим тестом Бонферрони).

Обсуждение

В этом исследовании мы показываем, что как ноцицептивные реакции, так и отнесенная механическая гипералгезия в брюшной стенке, вызванная внутрикостным введением низкой дозы горчичного масла (0.5%) были отменены обработкой «молекулярным скальпелем» RTX и антагонистом TRPA1 AP18, но не пуринергическим антагонистом TNP-ATP. Однако, когда использовалась более высокая доза (2,5%) горчичного масла, ноцицептивные реакции и отраженная гипералгезия почти полностью не зависели от RTX или AP18, но были существенно ингибированы TNP-ATP.

Наши результаты показывают, что системная обработка RTX полностью устраняет окрашивание TRPV1 в DRG и заметно снижает мРНК TrpV1 , указывая на то, что RTX успешно устраняет подавляющее большинство нейронов, экспрессирующих TRPV1.Мы также показываем, что обработка RTX заметно снижает мРНК TrpA1 в той же степени, что и мРНК TrpV1 . Эти результаты предполагают, что нейроны TRPA1 + также были уничтожены этим нейротоксином, и согласуются с ранее описанным расположением нейронов TRPA1 + в подмножестве ноцицепторов, экспрессирующих TRPV1 (Story et al., 2003; La et al., 2011; Le Pichon и Чеслер, 2014). Удаление нейронов, экспрессирующих TRPV1 (и последующее удаление нейронов TRPA1 +), привело к отмене ноцицептивного поведения, вызванного внутриподошвенным введением низкой дозы формалина или горчичного масла, как показано здесь и в предыдущих исследованиях (Shields et al., 2010), что указывает на функциональное нарушение TRPA1 + нейронов под действием RTX. Ноцицептивное поведение и отраженная гипералгезия, вызванная 0,5% горчичным маслом, введенным интра-толстым путем, также были устранены не только удалением TRPV1-экспрессирующих нейронов, но также антагонистом TRPA1 AP18, поддерживающим избирательное TRPA1-опосредованное действие на висцеральную боль, вызванную этим химическим раздражителем, когда используется в этой низкой дозе. Эти последние результаты согласуются с предыдущими исследованиями, показывающими, что боль, вызванная подобными дозами горчичного масла, купировалась антагонизмом TRPA1 (Pereira et al., 2012).

При использовании более высокой дозы горчичного масла внутри толстой кишки (2,5%) полученные нами результаты были диаметрально противоположными. RTX или AP18 индуцировали некоторое улучшение ноцицептивных ответов на начальной стадии после интра-толстого введения горчичного масла, но уже через 5 минут после введения химического раздражителя ноцицептивные ответы больше не изменялись обработкой RTX или AP18. Отмеченная гипералгезия после нанесения 2,5% горчичного масла также показала ограниченную (незначительную) чувствительность к AP18 и отсутствие чувствительности к RTX.Следовательно, в течение первых 5 минут после применения этой высокой дозы горчичного масла активация TRPA1 оказала некоторое влияние на наблюдаемые поведенческие эффекты, тогда как в более поздние моменты времени (5–20 минут) висцеральная боль перестала зависеть от этого механизма.

Мы наблюдали, что введение высокой дозы горчичного масла в толстую кишку вызывало заметные гистологические изменения в толстой кишке. К ним относятся выраженный отек, который отсутствовал после удаления нейронов TRPV1 +. Известно, что активация TRPA1 приводит к локальному высвобождению нейропептидов, таких как вещество P или пептид, связанный с геном кальцитонина (CGRP), среди других, которые вызывают расширение сосудов и повышенную проницаемость сосудов, что способствует появлению отека (Engel et al., 2011; Мацуда и др., 2019). Следовательно, у мышей с аблацией нейронов TRPV1 + отсутствие отека после высокой дозы горчичного масла может быть связано с действием TRPA1. Однако, поскольку RTX не влиял ни на поздние ноцицептивные реакции, ни на отраженную гипералгезию, несмотря на заметное ингибирование отека, вызванного горчичным маслом, участие этого нейрогенного воспаления в висцеральной боли, вызванной 2,5% горчичным маслом, по-видимому, ограничено.

Используя pERK1 / 2 в качестве маркера нейрональной активации и центральной сенсибилизации после вредной стимуляции (Gao and Ji, 2009), мы обнаружили, что 2.5% горчичное масло вызывало значительную активацию нейронов в основном в поверхностном дорсальном роге, но также и вокруг центрального канала (пластинка X), что полностью согласуется с предыдущими исследованиями, в которых использовались эквивалентные маркеры нейрональной активации (экспрессия Fos ) (Traub and Murphy, 2002). ). Интересно, что мы показываем, что удаление нейронов TRPV1 + устраняет только ограниченную часть клеток pERK1 / 2 + в поверхностном дорсальном роге, не затрагивая pERK1 / 2 в пластинке X, что полностью согласуется с избирательным расположением центральных окончаний TRPV1. афференты в пластинке I и внешней пластине II (Cavanaugh et al., 2009). Следовательно, значительная часть нейрональной активации после интра-толстого введения высокой дозы горчичного масла не зависела от нейронов TRPV1 (и, следовательно, не была связана с действиями TRPA1), что может объяснить, почему ноцицептивное поведение и отраженная гипералгезия могут все еще присутствовать, несмотря на устранение предполагаемой нейрональная мишень горчичного масла. Эти результаты ясно указывают на роль дополнительных механизмов, отличных от активации TRPA1, в управлении болевым поведением после интра-толстого введения 2.5% горчичное масло.

В дополнение к отечному ответу толстой кишки, вызванному высокой дозой горчичного масла, мы также наблюдали серьезное повреждение эпителия толстой кишки, которое не зависело от нейронов, экспрессирующих TRPV1, учитывая, что оно не было изменено удалением ноцицепторов TRPV1 +. с RTX. Сообщалось, что горчичное масло способно разрушать барьер плотного соединения, по крайней мере, в культивируемых эпителиальных клетках желудка, независимо от TRPA1 (Tashima et al., 2014), и этот эффект может частично объяснять повреждение тканей, о котором мы сообщаем. здесь.Цитозольные факторы, высвобождаемые после гибели клеток, как известно, представляют собой быстрые ноцицептивные сигналы, а цитозольный АТФ является одной из наиболее важных молекул-посредников в запуске ноцицепции после этого процесса (Cook and McCleskey, 2002). Сенсорные нейроны экспрессируют пуринергические рецепторы семейства P2X для обнаружения внеклеточного АТФ, и мы показываем, что антагонист P2X TNP-ATP был способен заметно снижать как поздние ноцицептивные ответы, так и отраженную гипералгезию, вызванную 2,5% горчичным маслом, что указывает на то, что ATP ( а не активация TRPA1) способствует болевому поведению.Насколько нам известно, это первый отчет, показывающий, что действие горчичного масла на болевое поведение может быть отменено пуринергическим антагонистом. Однако сообщалось, что TNP-ATP снижает ноцицептивные ответы или активацию нейронов, вызванную висцеральной стимуляцией уксусной кислотой (Honore et al., 2002; Xu et al., 2008), что, как и высокая доза горчичного масла, может быть может вызывать повреждение тканей с последующим высвобождением АТФ. Стоит отметить, что TNP-ATP является конкурентным антагонистом с наномолярным сродством к рецепторам P2X1 и P2X3, тогда как он на несколько порядков менее эффективен в отношении других рецепторов P2X (обзор North and Jarvis, 2013).Рецепторы P2X1 экспрессируются в DRG на незначительных уровнях (Xu and Huang, 2002; Chen et al., 2016), но высоко экспрессируются в гладких мышцах и тромбоцитах (Mahaut Smith et al., 2019). Следовательно, маловероятно, что рецепторы P2X1 участвуют в ноцицептивных эффектах, вызываемых 2,5% горчичного масла. Однако подтип P2X3 хорошо изучен в физиологии боли (Burnstock, 2016). Известно, что пептидергические и непептидергические ноцицепторы представляют собой хорошо обособленные популяции нейронов у мышей (Zwick et al., 2002; Прайс и Флорес, 2007; Montilla-García et al., 2018), и хотя рецепторы P2X3 экспрессируются непептидергическими нейронами у этого вида, TRPV1 экспрессируется пептидергическими ноцицепторами (Zwick et al., 2002). Следовательно, принимая во внимание, что АТФ ощущается экспрессирующими P2X нейронами, которые отличаются от ноцицепторов, экспрессирующих TRPV1, активация P2X АТФ, высвобождаемого после повреждения ткани, может частично объяснять как активацию pERK в спинном мозге, так и обнаружение того, что болевое поведение в ответ на высокие дозы горчичного масла, по-видимому, не зависят от нейронов TRPV1 +, как сообщается здесь.

Научные доказательства роли рецепторов TRPA1 и P2X3 в обработке боли привели к разработке селективных антагонистов для обеих мишеней. Несколько антагонистов TRPA1 проходят клинические испытания для лечения послеоперационной или нейропатической боли и в настоящее время проходят клиническую проверку (Souza Monteiro de Araujo et al., 2020). Пока что ни один из них не вызывает побочных эффектов, но окончательные данные об их эффективности и безопасности еще не доступны общественности (Souza Monteiro de Araujo et al., 2020). Кроме того, антагонисты P2X3 проходят клинические испытания с многообещающими результатами в отношении боли при остеоартрите и с хорошим профилем безопасности, поскольку сообщалось, что после лечения часто наблюдаются только нарушения вкуса (гипогевзия или дисгевзия) (Krajewski, 2020). Хотя и TRPA1, и P2X были предложены в качестве многообещающих фармакологических мишеней для лечения висцеральной боли (например, Lapointe and Altier, 2011; Burnstock, 2017), наши результаты показывают, что когда висцеральная боль вызвана повреждением ткани, облегчение боли за счет антагонизма P2X, по-видимому, помогает быть намного более эффективным, чем ингибирование TRPA1.У пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника, такими как болезнь Крона и язвенный колит, наблюдаются макроскопические болезненные поражения в толстой кишке (Gecse and Vermeire, 2018). Следовательно, мы можем предположить, что пуринергический антагонизм может с большей вероятностью показать эффективность, чем ингибирование TRPA1 в этой популяции пациентов.

Стоит отметить, что TNP-ATP не полностью изменил болевое поведение или отразил гипералгезию, вызванную высокой дозой горчичного масла, что позволяет предположить, что в болевом поведении участвуют другие механизмы, помимо TNP-ATP-чувствительных рецепторов P2X.Они могут включать другие пуринергические рецепторы (нечувствительные к TNP-ATP), а также множество дополнительных процицептивных медиаторов, таких как глутамат, кинины, цитокины и трофические факторы, которые, как и АТФ, как известно, способствуют возникновению боли после повреждения ткани (Amaya и др., 2013). Следовательно, наше открытие частичного эффекта TNP-ATP на висцеральную боль после повреждения ткани, вызванного 2,5% горчичным маслом, можно объяснить одновременным участием дополнительных механизмов, комплементарных активации P2X.

В заключение, мы обнаружили, что низкая доза (0,5%) внутрикостного горчичного масла вызывает висцеральную боль у мышей, что полностью зависит от действия TRPA1, тогда как при использовании высокой дозы (2,5%) этого химического раздражителя, висцеральная боль перестает зависеть от активации TRPA1 уже через 5 минут после введения, и на нее влияют рецепторы P2X, предположительно активируемые АТФ, высвобождаемым в поврежденной ткани. Предлагаемые механизмы воздействия низкой и высокой дозы горчичного масла проиллюстрированы на рисунке 9.Следовательно, ингибирования TRPA1 недостаточно для существенного уменьшения висцеральной боли, возникающей в результате повреждения ткани, тогда как пуринергический антагонизм, по-видимому, является более эффективной стратегией.

РИСУНОК 9 . Предлагаемые механизмы эффектов, вызванных низкой и высокой дозой горчичного масла. Низкая доза (0,5%) горчичного масла внутри толстой кишки вызывает висцеральную боль способом, полностью зависящим от действия TRPA1, тогда как при использовании высокой дозы (2,5%) этого химического раздражителя висцеральная боль в значительной степени зависит от рецепторов P2X, предположительно активируемых посредством АТФ выделяется поврежденной тканью.

Заявление о доступности данных

Необработанные данные, подтверждающие выводы этой статьи, будут предоставлены авторами без излишних оговорок.

Заявление об этике

Уход за животными соответствовал институциональным (Комитет по этике исследований Университета Гранады, Испания), региональным (Хунта де Андалусия, Испания) и международным стандартам (Директива Совета европейских сообществ 2010/63).

Вклад авторов

Концептуализация, RG-C, MC, JMB и EJC; Сбор данных, RG-C, AM-G, GP, JMT, JC и EF-S; Написание – Оригинальный вариант: RG-C, JMB и EJC; Написание – рецензирование и редактирование, все авторы; Приобретение финансирования, JMB и EJC.

Финансирование

Это исследование было частично поддержано Государственным исследовательским агентством Испании (10.13039 / 501100011033) под эгидой MINECO (номер гранта PID2019-108691RB-I00) и Хунтой Андалусии (грант CTS-109).

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Благодарим К.Шашоку за улучшение использования английского языка в рукописи.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphar.2020.613068/full#supplementary-material.

Ссылки

Амая Ф., Идзуми Ю., Мацуда М. и Сасаки М. (2013). Травмы тканей и связанные с ними медиаторы обострения боли. Curr. Нейрофармакол . 11, 592–597. doi: 10.2174 / 1570159X11311060003

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Bandell, M., Стори, Г. М., Хван, С. В., Вишванат, В., Эйд, С. Р., Петрус, М. Дж. И др. (2004). Канал ядовитых холодных ионов TRPA1 активируется едкими соединениями и брадикинином. Neuron 41, 849–857. doi: 10.1016 / s0896-6273 (04) 00150-3

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Bourgeois, C., Werfel, E., Galla, F., Lehmkuhl, K., Torres-Gómez, H., Schepmann, D., et al. (2014). Синтез и фармакологическая оценка 5-пирролидинилхиноксалинов как нового класса периферически ограниченных агонистов κ-опиоидных рецепторов. J. Med. Chem . 57, 6845–6860. doi: 10.1021 / jm500940q

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Браз, Дж. М., и Басбаум, А. И. (2010). Дифференциальная экспрессия ATF3 в нейронах ганглия задних корешков выявляет профиль первичных афферентов, задействованных различными вредными химическими стимулами. Боль 150, 290–301. doi: 10.1016 / j.pain.2010.05.005

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar