Мелирование на начес техника: два стиля, два результата — Сеть салонов красоты Naturel Studio

Последнее обновление 22 мая 2020 г.

Техника штриховой пластинки используется для выделения в чистую культуру организмов (в основном бактерий) из смешанной популяции.Посевной материал наносится штрихами на поверхность агара таким образом, что он «разжижает» бактерии. Некоторые отдельные бактериальные клетки отделены друг от друга и находятся на значительном расстоянии друг от друга.

По мере разбавления исходной пробы путем нанесения ее на последовательные квадранты количество организмов уменьшается. Обычно к третьему или четвертому квадранту переносится только несколько организмов, которые дают дискретные колониеобразующие единицы (КОЕ).

Образец / посевной материал разбавляют, нанося его штрихом на поверхность чашки с агаром. При нанесении штрихов на последовательные участки чашки посевной материал разбавляют до такой степени, что через каждые несколько миллиметров на поверхности чашки с агаром осаждается только одна бактериальная клетка. Когда эти одинокие бактериальные клетки делятся и дают тысячи и тысячи новых бактериальных клеток, образуется изолированная колония. Чистые культуры могут быть получены путем сбора хорошо изолированных колоний и повторного нанесения штрихов на чашки со свежим агаром.

Распространено предположение, что изолированная колония бактерий является потомком одной бактериальной клетки (т. Е. Колония является клоном). Однако это не всегда так. У видов, у которых клетки образуют характерную группу во время деления клеток, колониеобразующая единица может развиваться из группы клеток, а не образовывать единую клетку. Например, скопления стафилококков, цепочки стрептококков и т. Д.

• Источник бактерий (исходная культура, предварительно заштрихованная пластина с агаром или любой другой посевной материал)
• Петля для посева
• Зажигалка / зажигалка
• Горелка Бунзена
• Лизол (10% об.)
• Пластина с агаром (питательный агар) или любая другая агаровая среда)
• Бумажные полотенца

• Используйте только небольшое количество посевного материала.
• Слегка нанесите штрихи, чтобы не выдолбить агар.
• Поджигайте петлю после нанесения полос в каждом квадранте.
• Убедитесь, что на поверхности пластины нет капель конденсированной влаги.

• Для получения изолированных колоний организма (в основном бактерий) на чашке с агаром. Это полезно, когда нам нужно разделить организмы в смешанной культуре (чтобы очистить / изолировать конкретный штамм от загрязняющих веществ) или когда нам нужно изучить морфологию колонии организма.
• Для идентификации организма: биохимические тесты для идентификации бактерий действительны только при выполнении на чистых культурах.

1. Стерилизуйте посевную петлю в горелке Бунзена, поместив петлю в пламя, пока она не станет докрасна. Дайте ему остыть.
2. Выберите изолированную колонию из культуры чашки с агаром и распределите ее по первому квадранту (примерно 1/4 чашки), используя тесные параллельные полоски, или вставьте петлю в пробирку / бутыль с культурой и удалите немного инокулята.Вам не нужен большой кусок.
3. Немедленно очень осторожно нанесите штрихами на посевную петлю четверть планшета, используя возвратно-поступательное движение (см. Область 1 на рисунке выше).
4. Подожгите контур снова и дайте ему остыть. Вернувшись к краю области 1, которую вы только что нарисовали, продолжите полосы до второй четверти пластины (область 2).
5. Подожгите контур снова и дайте ему остыть. Вернувшись к области, которую вы только что нарисовали (область 2), продлите полосы до третьей четверти пластины (область 3).
6. Подожгите контур снова и дайте ему остыть. Вернувшись к области, которую вы только что нарисовали (область 3), протяните полосы до центральной четверти пластины (область 4).
7. Зажгите петлю еще раз.

Планшет с штрихами инкубируют при 37 ° C в течение 24 часов. Внимательно осмотрите колонии, выросшие в чашке. Все колонии должны иметь одинаковый общий вид. Если имеется более одного типа колоний, каждый тип следует снова нанести штрихами на отдельную чашку, чтобы получить чистую культуру.

Список литературы

1. Это изображение было получено из библиотеки изображений общественного здравоохранения CDC. Изображение предоставлено: CDC / Джеймс Гэтани (ФИЛ #: 7925)

Здравствуйте, спасибо, что посетили мой блог. Я Танкешвар Ачарья. Ведение блога – моя страсть. Я работаю ассистентом. Профессор и микробиолог отделения микробиологии и иммунологии Академии медицинских наук Патана, Непал. Если вы хотите, чтобы я писал о каких-либо сообщениях, которые вы сочли запутанными / сложными, укажите в комментариях ниже.

Добро пожаловать в Microbugz – Метод изоляции полосок

Метод изоляции полосовой пластины

Один из самых важных методов, который вы изучите в этом семестре. как стремиться к изоляции. Как нетрудно догадаться, цель полос для изоляции – это производить изолированные колонии организма на чашке с агаром. Это полезно, когда вам нужно разделить организмы в смешанной культуре или когда вам нужно изучить морфологию колонии организма.

При нанесении полос для изоляции вы начнете с нанесения полос на части вашей чашки с агаром с посевным материалом. Затем вы проведете последовательную серию области вашей чашки, пытаясь разбавить исходный посевной материал таким образом, чтобы эти единичные колониеобразующие единицы (КОЕ) дадут рост изолированным колониям.

Для этого упражнения вам понадобится распылитель 10% лизола, бумажный полотенца, тарелка с питательным агаром, горелка Бунзена, ударник, посев петлю и исходную культуру, из которой следует взять посевной материал.Sharpie тоже будет полезно.

Использование правильного техника, пламя вашей петли.

Вставьте петлю в пробирку и удалите посевной материал. Тебе не нужно огромный кусок.

Используя схему на странице 121 вашей книги (или схему, предоставленную инструктором), нанесите полосу на первую часть своей тарелки. Пламя ваш цикл снова.

Прикоснитесь петлей к незасеянному участку агара, чтобы он охладился перед используя его, чтобы управлять своим организмом.Используя диаграмму, нарисуйте вторая часть пластины.

Снова зажгите петлю и снова прикоснитесь к незараженной части пластины, чтобы охладить его. Снова воспользуйтесь диаграммой и проведите третью полосу. квадрант.

Снова зажгите петлю, охладите ее и нанесите полоску на последний квадрант помощь вашей диаграммы.

Зажгите петлю еще раз.

Асептические лабораторные методы: методы нанесения покрытия

8.Репрезентативные результаты

Метод полосовой пластины. Пример применения для нанесения гальванических покрытий показан на Рис. 1 . Эта процедура используется для выделения бактериальных колоний из смешанных культур клеток и на сегодняшний день является одним из наиболее важных методов, которым необходимо овладеть в микробиологии и молекулярной генетике. Каждая колония представляет собой популяцию генетически идентичных клеток. Для многих последующих применений обязательно начинать либо с одной колонии, либо с чистой бактериальной культуры, полученной путем инокуляции среды клетками из одной колонии.Например, морфологию отдельных клеток в колонии можно исследовать с помощью светового микроскопа. Генетическая идентичность может быть определена путем секвенирования гена малой субъединицы рибосомной РНК из геномной ДНК, выделенной из культуры клеток, начатой ​​с одной колонии. А метаболические характеристики можно описать, подвергая клетки различным биохимическим и физиологическим исследованиям. Только проводя такие эксперименты с чистыми культурами, можно быть уверенным в свойствах, приписываемых конкретному микроорганизму.Результаты не омрачены возможностью заражения культуры. Технические ошибки могут возникнуть, если стерильность инструмента, используемого для штриховки клеток по планшету, не сохраняется на протяжении всей процедуры. Если вы забудете зажечь петлю или достать свежую зубочистку между квадрантами, получение одиночных колоний затруднено. Некоторые виды бактерий не могут быть изолированы в чистой культуре, поскольку они зависят от совместной ассоциации с другими видами бактерий для определенных потребностей роста.Эти организмы, называемые синтрофами, можно выращивать только в условиях совместного культивирования, поэтому колонии (если они образованы) всегда будут состоять из двух или более видов. Еще одна проблема, с которой сталкиваются в лаборатории при выполнении процедуры штрих-планшета с бактериями, полученными из образцов окружающей среды, заключается в том, что клетки демонстрируют характеристики роста, которые отличаются от традиционных лабораторных штаммов, таких как E. coli . Такие бактериальные штаммы могут образовывать нитчатые колонии (в отличие от плотных скоплений клеток) с ветвями, которые распространяются по большой части чашки с агаром, кальцинированы и, таким образом, устойчивы к проникновению с помощью прибора для полосовой пластинки или окружены липкой капсулой. так что отдельные колонии невозможно различить.Эти характеристики затрудняют очистку отдельных колоний методом штрих-пластин.

Техника разливки. При использовании метода выливания на чашку колонии образуются внутри агара, а также на поверхности агаризованной среды, что обеспечивает удобный способ подсчета количества жизнеспособных клеток в образце. Эта процедура используется в различных промышленных приложениях. Например, это важно для очистных сооружений, которые отвечают за очистку жидких отходов (например,g., сточные воды, стоки из ливневых стоков), образующиеся в жилых, коммерческих и промышленных объектах, а также в результате сельскохозяйственной практики, для анализа проб воды после обширного процесса очистки. Очищенные сточные воды (непитьевая вода) повторно используются различными способами – для орошения непищевых культур в сельском хозяйстве, для санитарной промывки жилых домов и в промышленных градирнях – поэтому они не должны иметь химического и микробного загрязнения. Питьевая вода (питьевая вода) должна быть очищена в соответствии со стандартами EPA и проверена с использованием методов микробиологического посева, которые позволяют подсчитывать конкретные патогены человека.На рисунке показаны колонии бактерий , образовавшиеся из бактериальных клеток, присутствующих в пробе воды, взятой из общественного питьевого фонтана. Маловероятно, что бактериальные патогены продуцируют эти колонии, учитывая меры по очистке питьевой воды; однако микробы есть повсюду, и заражение даже непатогенными штаммами можно только минимизировать, а не полностью устранить. В качестве другого примера фармацевтической компании необходимо оценить степень микробного загрязнения или бионагрузку нового лекарства во время производства, хранения и транспортировки.Путем отбора проб лекарственного средства на различных этапах процесса и посева образцов с использованием процедуры заливки на тарелку можно легко определить микробную нагрузку или количество контаминирующих бактерий. Затем можно разработать меры предосторожности для сведения к минимуму или устранения микробного загрязнения. Одной из наиболее распространенных технических ошибок, возникающих при выполнении метода разливки на чашке, является недостаточное перемешивание образца с расплавленным агаром, что приводит к слипанию колоний, что приводит к неточному подсчету на чашках.Другой частой ошибкой является заливка расплавленного агара, когда он слишком горячий, что приводит к гибели многих бактериальных клеток в образце. Эта ошибка также повлияет на точность подсчета на чашках, давая числа, которые занижают общее количество колониеобразующих единиц в образце.

Техника раскладывания пластин. Метод «насыпной тарелки» аналогичен процедуре разливной тарелки по своей полезности в качестве средства для подсчета жизнеспособных чашек. Однако, поскольку колонии, которые образуются с использованием метода распределения на чашках, равномерно распределены по поверхности агаровой среды, клетки из отдельных колоний могут быть выделены и использованы в последующих экспериментальных манипуляциях (например,g., как посевной материал для посевов на планшетах или бульонных культур). Три распространенных применения, в которых важным компонентом является метод распределения пластин, – это эксперименты по обогащению, отбору и скринингу. Во всех трех случаях требуемый тип клеток может быть отделен от смеси, а затем подвергнут любому количеству биохимических, физиологических или генетических тестов.

Эксперимент по обогащению включает посев смешанной культуры на среду или инкубационные чашки в условиях окружающей среды, которые способствуют росту тех микроорганизмов в образце, которые демонстрируют желаемые метаболические свойства, характеристики роста или поведение.Эта стратегия не подавляет рост других организмов, но приводит к увеличению количества желаемых микроорганизмов по сравнению с другими в культуре. Таким образом, колонии, которые образуются на чашке для обогащения, вероятно, проявляют фенотипические свойства, которые отражают желаемый генотип. Например, если вашей целью является культивирование азотфиксирующих бактерий из образца окружающей среды, содержащего смесь более чем 1000 различных видов бактерий, то нанесение образца на среду с дефицитом азота обогатит те бактерии, которые могут продуцировать это соединение из атмосфера, используя метаболические возможности, обеспечиваемые набором генов, необходимых для фиксации азота.

Селекционный эксперимент включает высев смешанной культуры на среду, которая позволяет расти только тем клеткам, которые содержат конкретный ген или набор генов. Этот тип экспериментов распространен в лабораториях молекулярной биологии при трансформации бактериальных штаммов плазмидами, содержащими гены устойчивости к антибиотикам. Если ваша цель – культивировать только рекомбинантные клетки или те, которые успешно захватили плазмиду, то при посеве образца на среду с соответствующей концентрацией антибиотика будут отбираться те клетки, которые проявляют устойчивость к этому конкретному лекарству.

Скрининговый эксперимент включает высев смешанной культуры на среду, которая позволяет всем жизнеспособным клеткам расти; однако клетки с желаемым генотипом можно отличить от других клеток на основе их фенотипа. Опять же, этот тип экспериментов распространен в лабораториях молекулярной биологии при проведении анализов мутагенеза или клонировании генов в плазмиды. Классический пример, показанный на рис. 11 , использует ген lacZ , кодирующий β-галактозидазу; этот фермент позволяет клеткам метаболизировать X-Gal (5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозид), субстратный аналог его природного субстрата, лактозы.Расщепление X-Gal β-галактозидазой приводит к нерастворимому синему продукту. Таким образом, если среда содержит X-gal, и образец, содержащий клетки либо с диким типом (функциональным), либо с мутантным (нефункциональным) геном lacZ , высевают на эту среду, то после инкубации клетки дикого типа, несущие функциональный ген lacZ появится в виде колоний с синим пигментом, в то время как мутантные клетки с нефункциональным геном lacZ появятся в виде непигментированных («белых») колоний.

Техническая проблема, с которой чаще всего сталкиваются при первом обучении применению метода распределения на чашках, – это неравномерное распределение клеток по поверхности агара.При использовании вращающегося подноса и стеклянного стержня образец может абсорбироваться слишком быстро, так что колонии образуются только около центра планшета. При выполнении «метода Копакабаны» стеклянные шарики вращаются, а не встряхиваются по поверхности агара. Следовательно, вдоль внешнего края чашки растет множество колоний. В любом случае результирующее распределение колоний не использует преимущества всей доступной площади поверхности, поэтому клетки могут слипаться и расти в перекрывающиеся колонии, что делает подсчет на чашках неточным или различение типов клеток невозможным.

Метод наложения мягкого агара . Для подсчета количества фагов можно использовать процедуру, аналогичную методике распределения на чашках, используемой для подсчета бактериальных колоний. В то время как от 30 до 300 бактериальных клеток распределяют по поверхности агара для подсчета на чашках (КОЕ / мл), от 100 до 400 инфекционных фаговых частиц смешивают с 10 ⁸ -10 ⁹ клетками-хозяевами для подсчета бляшек (БОЕ / мл). ) в слое мягкого агара, распределенного по поверхности твердого питательного агара.Если не продемонстрировано иное, обычно предполагается, что одна бактериальная клетка делится и накапливает большое количество генетически идентичных клеток в едином кластере, называемом колонией. Как обсуждалось ранее, это предположение неверно, когда клетки растут группами (то есть парами, тетрадами, цепочками или кластерами) или демонстрируют характеристики роста, такие как капсулы, которые препятствуют образованию одиночных колоний. Аналогичное предположение сделано для образования бляшек в том смысле, что каждая бляшка представляет активность отдельного фага.Это утверждение верно только в том случае, если один фаг заражает одну бактерию. Что произойдет, если несколько фаговых частиц заразят одну бактерию? Эта проблема относится к важному статистическому параметру, который необходимо учитывать при проведении экспериментов с фагом, – множественности инфекции (MOI), описывающей отношение инфекционных фаговых частиц к количеству клеток-хозяев в образце. Поскольку некоторые клетки адсорбируют более одного фага, в то время как другие клетки адсорбируют только один фаг или ни одного фага, популяция клеток-хозяев должна быть инфицирована с низким MOI (≤1), чтобы минимизировать вероятность того, что клетка будет инфицирована более чем одной фаговой частицей. .Использование единицы образования бляшек (БОЕ) в качестве функционального определения позволяет избежать этих осложнений при выполнении подсчета бляшек для расчета титра запаса фага.

Как показано на Рис. 12 , морфология бляшек различается для разных фагов. Некоторые фаги образуют небольшие бляшки (панель A), тогда как другие образуют большие бляшки (панель B). На размер налета влияет ряд переменных. Этой изменчивости способствуют технические причины. Например, полная среда и толстый жесткий агар поддерживают развитие более крупных бляшек, поскольку клетки-хозяева могут поддерживать рост фага в течение более длительного периода времени.Высокая плотность посева клеток-хозяев (> 10 ⁹ КОЕ на чашку) вызовет уменьшение размера бляшек. Использование более низких концентраций мягкого агара увеличит скорость диффузии фаговых частиц в мягком агаре и, таким образом, увеличит размер бляшек. Напомним, что эта повышенная скорость диффузии может произойти непреднамеренно, если чашки с твердым агаром не полностью высохли, так что конденсация или избыток влаги в чашке разбавляют мягкий агар в верхнем слое. Такой технический надзор приведет к противоречивым результатам в отношении размера бляшек для конкретного фага.

Размер бляшек также связан с рядом событий клетки-хозяина, включая эффективность адсорбции, продолжительность латентного периода (промежуток времени от адсорбции фага до лизиса клетки-хозяина) и размер вспышки (количество потомков выпущен однократной инфекцией). Гетерогенная смесь размеров бляшек может наблюдаться, если частицы фага инфицируют клетки-хозяева на разных фазах роста бактерий. Например, те, которые адсорбируются во время ранней экспоненциальной фазы, образуют более крупные бляшки с большим количеством фагов-потомков, чем те, которые адсорбируются в поздней экспоненциальной фазе.Как правило, литический фаг образует прозрачные бляшки, в то время как лизогенный фаг образует мутные бляшки. Однако некоторые литические фаги производят интересные образцы, такие как бляшка «бычий глаз», показанная на , фиг. 12В, . Эти прозрачные бляшки окружены мутным ореолом, потому что клетки на краю бляшки не полностью лизированы или могут быть устойчивыми к фаговой инфекции. Образец «бычьего глаза», наблюдаемый для умеренного фага, представляет собой бляшку с мутным центром, окруженную прозрачным кольцом. Эта морфология отражает MOI и физиологию клетки-хозяина в отношении решения о лизисе-лизогении.Когда клетки впервые инфицированы фагом, MOI низкий, и клетки быстро растут из-за обилия питательных веществ; вместе это способствует литическому росту. По мере того, как лизируется все больше и больше клеток, MOI увеличивается и образуется прозрачная бляшка. Однако лизогены в центре зубного налета продолжают расти, потому что они невосприимчивы к лизису, в результате чего образуется прозрачный зубной налет с мутным центром.

Метод наложения может быть изменен для анализа бляшек с эукариотическими вирусами. Точно так же бактериофаги образуют бляшки на лужайке бактериальных клеток в мягком агаре, эукариотические вирусы образуют бляшки на монослое клеток, покрытых гелем.Монослой – это сливающийся лист клеток, растущих бок о бок на поверхности чашки для культивирования, соприкасающихся друг с другом, но не растущих друг на друге. Для проведения этого типа анализа бляшек аликвоты вируса добавляют к чувствительным монослоям эукариотических клеток. Затем монослой покрывают питательной средой на основе агарозы – этот гель ограничивает распространение потомства вирусов, высвобождаемых из инфицированных клеток, в соседние клетки в монослое. Соответственно, образуется сферическая область или бляшка, содержащая клетки, поврежденные высвобождением вирионов.Чтобы облегчить визуализацию бляшек, на культуру клеток можно наносить красители, окрашивающие живые клетки, обеспечивая контраст между инфицированными и неинфицированными клетками.

Техника наложения мягкого агара используется для экспериментов, отличных от анализа бляшек. Во-первых, важно помнить, что агар с твердыми питательными веществами представляет собой поддерживающую матрицу, которая способствует росту бактерий. Во-вторых, мягкий агар, используемый для наложения, может иметь другой питательный состав, чем жесткий агар. Таким образом, мягкий агар может служить средством анализа бактериальных штаммов на предмет различных характеристик роста или метаболических свойств.Например, метод наложения используется для скрининга бактерий на способность разрушать целлюлозу (Тизер и Вуд, 1982). Отдельные колонии выращивают на неселективной жесткой агаровой среде, затем мягкий агар, содержащий 0,1% (мас. / Об.) Карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ), распределяют по поверхности жесткого агара. После инкубации чашки залиты красителем, который позволяет визуализировать зоны просветления вокруг колоний в мягком агаре. Очистка вызывается гидролитическими ферментами, выделяемыми бактериями, разрушающими целлюлозу в среде.Совсем недавно метод наложения был использован для обнаружения бактерий, которые подавляют рост метаногенных архей, обнаруженных в рубце домашнего скота (Gilbert et al .2010). Бактериальные изоляты из образцов окружающей среды выращивают на питательной среде с твердым агаром, затем колонии покрывают мягким агаром, содержащим культуру метаногенов. После инкубации чашки проверяют на наличие зон задержки роста вокруг колоний. Этот метод определяет штаммы бактерий, которые продуцируют ингибиторы метаногенов в мягком агаре.

Наиболее частые технические ошибки, возникающие при использовании метода наложения мягкого агара, – это заливка расплавленного мягкого агара, когда он слишком горячий или слишком холодный. Если она слишком горячая, смешанные со средой бактериальные клетки погибнут перед посевом. Если он будет слишком холодным, мягкий агар сформирует комки при выливании на жесткий агар. В любом случае результаты будут в лучшем случае неоднозначными или нечитаемыми.

Реплика-пластина Процедура . Перенос культур из одного типа питательной среды в другой для проверки требований к росту становится довольно трудоемким, если штаммов больше, чем несколько.Посев на реплики – это метод, позволяющий одновременно проводить скрининг большого количества микроорганизмов. Например, после мутагенизации культуры клеток дикого типа можно развести разведенную культуру на чашках, чтобы получить чашки с отдельными колониями. Первичные чашки содержат среду, которая поддерживает рост всех клеток, включая прототрофов дикого типа, которые синтезируют все соединения, необходимые для роста, и мутантных ауксотрофов, которые несут генетическую мутацию в пути биосинтеза, что делает их неспособными синтезировать определенные соединения, необходимые для роста.Посев смеси клеток на полную среду, недостающие питательные вещества могут быть извлечены из окружающей среды. Чтобы различать прототрофы и ауксотрофы, колонии можно реплицировать на минимальную среду. Только прототрофы смогут расти. Поскольку пространственный рисунок первичной чашки сохраняется, сравнение вторичной чашки с первичной чашкой позволяет идентифицировать мутантные колонии. Чтобы определить, какое соединение мутанты больше не способны синтезировать, колонии можно реплицировать на минимальную среду с добавлением определенных соединений (например,г., аминокислоты, источники углерода, витамины и т. д.). Таким образом, можно проводить скрининг сотен колоний одновременно с использованием процедуры реплик-планшета. Одна техническая ошибка, которая может произойти, заключается в использовании слишком влажных чашек с агаром, в результате чего колонии сливаются вместе, загрязняя все культуры на чашке. Это дает совершенно ненадежные результаты. Еще одна техническая ошибка – слишком большое давление при переносе ячеек с вельвета на вторичные пластины. Опять же, после инкубации вторичных чашек образовавшиеся колонии могут перекрываться, давая фенотипы роста, связанные с контаминацией, а не ауксотрофией.

Не все виды микробов дикого типа являются прототрофами, поэтому процедуру реплик-планшета можно использовать для одновременного скрининга различных штаммов дикого типа на предмет характерных требований для роста. Как показано на фигуре , фиг. 13 , «мазки» клеток из четырех различных бактериальных штаммов Pseudomonas помещали в двух экземплярах на помеченный сеткой планшет, содержащий полную среду, называемую YTA (панель A). Затем штаммы реплицировали на трех вторичных планшетах (панели B, C и D), состоящих из минимальной среды (MSA), дополненной другим источником углерода (ацетамидом, лактозой и глицином, соответственно).Результаты показывают, что два из четырех штаммов Pseudomonas ( P. aeruginosa и P. stutzeri ) неспособны расти на этих трех источниках углерода. В качестве контроля штаммы реплицировали на четвертый планшет со средой YTA для подтверждения переноса клеток на протяжении всей процедуры. Поскольку все четыре штамма растут на контрольном планшете YTA, дефицит роста, проявленный на предыдущих трех планшетах в серии, является надежным. Результаты покрытия реплик приведены в таблице Table 1 .Одна из распространенных ошибок – это интерпретация отпечатка роста на вторичной пластине как положительный результат. Например, сравните фенотип P. aeruginosa с фенотипом P. stutzeri на MSA + ацетамид (панель B). Последний показывает отпечаток роста, что является отрицательным результатом и может возникнуть, если питательные вещества из предыдущей чашки переносятся с родительскими клетками. Рост новых клеток не происходит, потому что недостающие питательные вещества недоступны для дочерних клеток. Отпечаток легко спутать с реальным ростом.Если есть сомнения, эксперимент следует повторить, используя альтернативный метод, такой как нанесение штрихов клеток с первичного планшета на вторичную среду.

Рисунок 1. Пример одиночных колоний на чашке. Розовые сферы около центра чашки – это колонии Serratia marcescens , грамотрицательной палочковидной Proteobacterium из семейства Enterobacteriaceae. Из-за того, что он предпочитает влажную среду, этот микроорганизм обычно растет в углах ванн, в раковинах, в затирке для плитки и на занавесках для душа. S. marcescens легко распознать, поскольку он производит красноватый пигмент, называемый продигиозин. Колонии на этом планшете были созданы с использованием метода штрих-планшетов, при этом отдельные колонии появлялись в четвертом квадранте после инкубации при 30 ° C в течение 24 часов. В трех других квадрантах наблюдается сплошной рост, при котором клетки, отложившиеся на поверхности агара, превратились в перекрывающиеся колонии.

Рисунок 2. Инструменты, используемые для метода штрих-пластин. Сверху вниз показаны зубочистки (плоские, а не круглые), проволочная петля, одноразовая пластиковая петля и деревянные палочки.Зубочистки обычно переносятся в небольшой стеклянный стакан широким концом вниз, а затем накрываются фольгой при автоклавировании для стерилизации перед использованием. Деревянные палочки переносят в 18-миллиметровые пробирки, затем автоклавируют для стерилизации перед использованием.

Рис. 3. (A) Метод полосатых пластин с использованием квадрантного метода. Предварительно стерилизованная петля, палочка или зубочистка используется для распределения образца по четверти поверхности агара быстрым, плавным обратным и четвертым движением от края к центру чашки.Это действие повторяется для каждого из четырех квадрантов пластины. После инкубации рост клеток появляется вдоль пути инструмента, используемого для внесения клеток на планшет. Механическое разделение клеток в смешанном образце с использованием этого метода должно привести к образованию отдельных колоний в четвертом квадранте (см. Пример , рис. 1, ). Одиночные колонии называются колониеобразующими единицами (КОЕ). (B) Когда металлическая петля используется для посева полос, она должна быть стерилизована пламенем горелки Бунзена до контакта с посевным материалом или агаровой средой.Напомним, что самая горячая часть пламени – это кончик синего конуса. Удерживая ручку инструмента, поместите проволоку в огонь примерно на расстоянии 3-4 дюймов от петли. Подождите, пока проволока не станет докрасна. Переместите проволоку так, чтобы пламя приблизилось к петле. Прежде чем прикасаться к посевному материалу, убедитесь, что металлическая петля остыла.

Рис. 4. Техника разливки. (A) Небольшой объем образца (от 0,1 до 1,0 мл) в асептических условиях распределяется в пустую, но стерильную чашку Петри с использованием 5.Серологическая пипетка 0 мл. (B) Расплавленный агар, уравновешенный до температуры приблизительно 48 ° C, затем выливают в чашку Петри с образцом. После закрытия крышки планшет осторожно покачивают, чтобы перемешать образец и расплавленный агар. Агару дают возможность затвердеть в течение примерно 30 минут, затем планшеты переворачивают для инкубации.

Рис. 5. Техника раскладывания тарелок с поворотным столом и разбрасывателем стекла. После того, как чашку с агаром помещают на вращающийся столик, небольшой объем образца (0.От 1 до 0,2 мл) асептически распределяют по центру планшета с помощью микропипеточного дозатора. Разбрасыватель стерилизуют, погружая его в стакан с этанолом, а затем пропуская через пламя горелки Бунзена, чтобы зажечь избыток этанола. Перед контактом с образцом разбрасыватель следует охладить, прикоснувшись им к агару у края чашки. Распределитель осторожно перемещается вперед и назад через образец по пластине, в то время как поворотный стол медленно вращается. Это действие позволяет постепенно, но равномерно распределить образец по поверхности агара.После закрытия крышки планшет следует установить на столе в неподвижном состоянии не менее чем на 5 минут, чтобы образец полностью впитался в агар, прежде чем перевернуть планшет для инкубации.

Рис. 6. Техника намазывания стеклянными бусинами (метод Копакабаны). Стеклянные шарики, предварительно стерилизованные в автоклаве, выливают на поверхность чашки с агаром, стоящей на столе. Небольшой объем образца (от 100 до 150 мкл) в асептических условиях распределяется по центру агара с помощью микропипеточного устройства.При закрытой крышке планшета горизонтальное встряхивающее движение используется для осторожного перемещения шариков назад и вперед по пластине от 6 до 7 раз, распределяя образец. Это действие повторяется после поворота пластины на 60 °. Встряхивающее движение повторяется в третий раз после следующего поворота на 60 °. Как только образец полностью впитается в агаровую среду, шарики сливают в стакан, содержащий 10% отбеливателя. Затем чашки переворачивают для инкубации.

Рисунок 7. Метод наложения мягкого агара, используемый для выделения и подсчета фагов на основе образования бляшек (также называемый анализом бляшек).(A) Присутствие фага может быть обнаружено в виде зон просветления или бляшек на сливающейся суспензии бактериальных колоний, растущих в мягком агаре. Фаг T4 представляет собой вирулентный фаг с двухцепочечной ДНК, который инфицирует своего хозяина, Escherichia coli , заставляя клетки-хозяева лизировать и высвобождать фаг-потомок. После нескольких раундов инфицирования и лизиса соседние клетки E. coli в непосредственной близости от исходной инфицированной клетки-хозяина исчезают, оставляя бляшку, содержащую миллиарды частиц фага Т4.Фаг Т4 производит бляшки диаметром около 1 мм. В этом эксперименте 200 мкл разведения 10 ^-5 из 2 x 10 ⁸ БОЕ / мл исходного раствора фага Т4 смешивали с примерно 300 мкл индикаторных клеток E. coli , приготовленных в виде экспоненциально растущих, аэрированных культура при 37 ° С. И фаг, и бактерии добавляли в пробирку с мягким агаром EHA, перемешивали, затем выливали на поверхность чашки с твердым агаром EHA. Обратите внимание, что в этом случае не было необходимости позволять фагам и бактериям адсорбироваться перед посевом.После того как мягкому агару давали возможность застыть в спокойном состоянии в течение 20 минут, планшеты переворачивали и инкубировали при 37 ° C в течение 24 часов. (B) В отсутствие инфицирующих фаговых частиц рост бактерий приводит к образованию мутной суспензии клеток в мягком агаре, в которой отдельные колонии не видны. Вместо этого равномерная лужайка бактериальных клеток, в данном случае E. coli , образуется по всему мягкому слою агара.

Рисунок 8. Приготовление первичного планшета (мастера) с бактериальными образцами.Чтобы образцы были организованы, нижняя часть пластины может быть помечена сеткой, а полученные квадраты пронумерованы. Каждому образцу можно присвоить квадрат на сетке. Показаны примеры правильной и неправильной схемы посева. В идеале небольшое количество клеток переносят в центр квадрата с помощью стерильного инструмента для посева, такого как зубочистка, чтобы «промокнуть» образец (ячейка № 4). Распространенные ошибки при посеве, такие как те, что изображены в ячейке № 5 («участок») и ячейке № 6 («заполнение»), приводят к чрезмерному росту бактериальных образцов после инкубации, что приводит к загрязнению соседних квадратов.

Рисунок 9. Метод реплик-планшетов, используемый для переноса клеток с первичных на вторичные планшеты для фенотипических скринингов. Метка на первичном планшете совмещается с меткой на покрытом вельветом блоке, затем опускается, чтобы поверхность агара соприкасалась с тканью. Клетки переносятся с пластины на вельвет легким, но равномерным нажатием на основную пластину кончиками пальцев. Это действие оставит отпечаток образцов клеток на вельвете с тем же пространственным узором, что и на первичной пластине.Та же процедура используется для переноса клеток из вельвета на вторичную пластину. Можно засеять до 7-8 вторичных чашек с использованием одного и того же оттиска первичной чашки на вельвете. Последняя чашка, засеянная вельветом, должна служить положительным контролем. Это должна быть среда, которая поддерживает рост всех тестируемых штаммов, обеспечивая достаточный перенос клеток на протяжении всей серии планшетов. После инкубации вторичные чашки можно проверить и оценить на предмет роста по сравнению с отсутствием роста.Таким образом, несколько штаммов бактерий могут быть подвергнуты скринингу одновременно на нескольких питательных средах в одном эксперименте.

Рис. 10. Пример результата с использованием техники заливной плиты. Образец воды объемом 1,0 мл, взятый из питьевого фонтанчика, был помещен в стерильную пустую чашку Петри. Затем в чашку с образцом выливали расплавленный, но остывший YTA. Агар также содержал 100 мкг / мл циклогексимида для предотвращения роста дрожжей и плесени, которые могли присутствовать в образце воды.После осторожного перемешивания планшет ставили на плоскую поверхность и давали агару полностью затвердеть. Планшет инкубировали при 37 ° C в течение 48 часов. Показан результат этого эксперимента. Обратите внимание на разницу во внешнем виде поверхностных колоний, которые имеют большую и круглую форму, по сравнению с подповерхностными колониями, которые очень малы и имеют неправильную форму, потому что затвердевшая среда препятствует распространению колоний на подповерхностной поверхности.

Рис. 11. Пример результата с использованием техники распространения пластины.«Метод Копакабаны» использовали для посева смеси клеток E. coli для скринингового эксперимента. В этом случае ростовая среда (LB) содержит X-Gal, поэтому те клетки, которые экспрессируют функциональный фермент β-галактозидазы, образуют синие колонии, в то время как клетки с мутацией в гене lacZ и, таким образом, не могут экспрессировать функциональную β-галактозидазу. фермент образуют белые колонии. Эти два типа колоний, часто называемые «синим / белым экраном», можно легко отличить друг от друга на одной и той же чашке.

Рисунок 12. Пример результата анализа бляшек с использованием метода наложения мягкого агара. Показаны бляшки, образованные на штамме-хозяине Mycobacterium smegmatis mc ² 155 (ATCC 700084) двумя разными фагами: (A) разрушителями микобактериофагов и (B) микобактериофагами MSSS. Эти фаги были выделены студентами лабораторного курса MIMG 103L Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе весной 2010 года. M. smegmatis является непатогенной актинобактерией и принадлежит к семейству микобактерий, которое включает несколько патогенов, которые, как известно, вызывают серьезные заболевания, такие как туберкулез ( M.tuberculosis, M. africanum, M. bovis ) и проказой ( M. leprae ). Приблизительно 50 мкл разведения 10 ^-2 Destroyers и 10 разведения ^-3 MSSS инкубировали с 500 мкл M. smegmatis в течение 20 минут при 37 ° C, затем смешивали с MBTA (мягкий агар). и разливали на чашки с MHA (твердым агаром). После того как мягкому агару давали возможность застыть в спокойном состоянии в течение 20 минут, планшеты переворачивали и инкубировали при 37 ° C в течение 48 часов. Обратите внимание на различную морфологию бляшек, производимых каждым фагом.Разрушители (A) образуют небольшие (средний диаметр около 1 мм) прозрачные бляшки, характерные для литического фага, в то время как MSSS (B) образует большие бляшки типа «бычий глаз» с четкими центрами, окруженными мутным ореолом (средний диаметр примерно 3,2 мм). . Мутное кольцо может состоять из бактерий, устойчивых к фаговой инфекции. Этот паттерн отличается от паттерна, формируемого лизогенными фагами, которые продуцируют мутные бляшки.

Рис. 13. Пример результата с использованием процедуры реплики на планшете.Четыре штамма Pseudomonas ( P. aeruginosa, P. putida, P. fluorescens и P. stutzeri ) были протестированы в двух экземплярах на рост на трех различных источниках углерода: ацетамиде, лактозе и глицине. (A) Первичный планшет представляет собой полную среду (YTA), засеянную четырьмя штаммами, как указано. После инкубации при 30 ° C в течение 24 часов все четыре штамма растут на YTA. Первичный планшет использовали для репликации планшета на минимальную среду (MSA), дополненную одним источником углерода: ацетамидом (B), лактозой (C) и глицином (D).Последним планшетом в серии был планшет положительного контроля YTA (E). Как показано, штаммы демонстрируют различные модели роста после инкубации на вторичных чашках. Обратите внимание, что иногда бывает трудно отличить рост от отпечатка клеток. Например, сравните отпечаток, созданный P. stutzeri на трех пластинах MSA, с отсутствием роста на тех же трех пластинах P. aeruginosa . Оба результата являются отрицательными по сравнению с моделями роста P.putida и P. fluorescens . Однако все штаммы растут на планшете с положительным контролем, подтверждающие, что клетки переносили во все вторичные планшеты в серии. Результаты этого эксперимента приведены в таблице Table 1 .

Методика штриховой пластины для изоляции бактерий

Штрих для получения чистых бактериальных культур из клинического образца

83

92 0

92 0 Цель

92 0 чтобы разложить клинический образец на твердой питательной среде, чтобы выросли отдельные изолированные колонии бактерий.

Краткое содержание статьи: Нанесение штрихов клинического образца на чашку со средой – это способ выделения конкретных бактерий, позволяющий идентифицировать возбудителя бактериального заболевания.

Техника штриховой пластины для изоляции бактерий

Что такое бактериальная колония?

Как изолировать бактерии с помощью метода полосовой пластинки

Используя технику штриховой пластинки для распределения клинического образца по поверхности твердой питательной среды, можно изолировать отдельные типы бактерий. Вот основная техника. См. Фото с инструкциями, которое появляется вместе с этой статьей.

Расходные материалы, необходимые для посева штрихов:

• Чашка Петри со стерильной средой TSY (или специализированной питательной средой)
  

• Клинический образец (образец получен от человека)
  

Продолжение…

Последние шаги для завершения

Изоляционная пластина + видео.

Последнее обновление страницы: 11/2015

ПРИМЕЧАНИЯ К КЛАССАМ

с бесплатного образовательного сайта STEM

Что такое среда для роста бактерий?

Пошаговая инструкция для печати

Бесплатно из SPO

Методика с использованием штриховой пластинки:

• Нанесите мазок на клинический образец на четверть стерильной чашки Петри, двигаясь вперед и назад узор «торнадо». Это квадрант №1.
  

• Выбросьте тампон в пакет для биологически опасных отходов.
  

• Стерилизовать петлю в пламени горелки Бунзена или ступицу микроинсинератора.
  

• Дайте петле остыть, не размахивая ею.
  

• Поместите петлю в следующий квадрант чашки Петри, рядом с квадрантом №1. Осторожно перетащите петлю в квадрант № 1 несколько раз, чтобы получить немного бактерий из этого первого образца, затем распределите этот материал по квадранту № 2 в другом шаблоне торнадо.
  

• Снова простерилизуйте петлю в пламени горелки Бунзена или ступицу микроинсинератора и дайте петле остыть.
  

• Поместите петлю в следующий квадрант чашки Петри, рядом с квадрантом №2. Осторожно перетащите петлю в квадрант № 2 несколько раз, чтобы получить немного бактерий из этого образца, затем распределите этот материал по квадранту № 3 в виде торнадо.
  

Методы изоляции полосовой пластины

Хотя их нельзя увидеть невооруженным глазом, бактерии есть повсюду. Они существуют в пище, почве, воде, поверхностях в наших домах, а также внутри и на наших телах.Бактерии обычно существуют в смешанных популяциях. Изоляция конкретной бактерии от других видов бактерий в данном образце позволяет микробиологам изучать ее структуру и функции, а также характеристики, используемые при ее идентификации. Микробиологи часто выделяют бактерии, используя одну из нескольких методик.

Инструменты

Посевная петля используется для переноса микроорганизмов. Он состоит из нихромовой или платиновой проволоки с небольшой круглой петлей на одном конце. Другой конец прямой и вставляется в ручку.Также доступны пластиковые одноразовые посевные петли. Бактерии можно изолировать, только если они разрастаются. Микробиологи выращивают бактерии для выделения на планшетах с штрихами в неглубоких круглых чашках Петри, заполненных твердой средой, называемой агаром. Агар имитирует среду, в которой бактерии растут естественным образом. Чашки, заполненные средой, стерильны и закрыты для предотвращения роста нежелательных организмов. Во время изоляции планшетов с полосами посевная петля многократно стерилизуется в пламени горелки Бунзена.

Принцип

Метод полосовой пластинки – самый популярный метод выделения определенных бактерий из образца, содержащего смесь микроорганизмов.Эта техника существенно уменьшает количество организмов и снижает их плотность. Это позволяет микробиологам различать и изолировать отдельные бактериальные колонии. Колония – это видимое скопление бактерий. Все бактерии в одной колонии происходят из одной и той же бактериальной клетки. Следовательно, отдельные колонии являются «чистыми» колониями. Чистую колонию переносят в другую чашку для получения чистой культуры, состоящей из одного типа бактерий.

Процедура

Если все сделано правильно, изоляция на планшете с штрихом делает образец более тонким и позволяет отдельным бактериальным клеткам развиваться в изолированные колонии.Микробиолог начинает со стерилизации посевной петли в пламени. Она охлаждает петлю, касаясь ею агара, затем погружает петлю в образец и распределяет ее взад и вперед, чтобы покрыть часть чашки. Она стерилизует петлю, охлаждает ее и инокулирует вторую, прилегающую секцию пластины, протягивая петлю через первую секцию несколько раз и покрывая вторую секцию зигзагообразным движением. Это улавливает небольшое количество бактерий из первой секции и переносит их во вторую секцию.Количество повторений этой базовой процедуры зависит от используемого метода полосовой пластинки. Несмотря на метод, исходный образец используется для инокуляции только первой части чашки.

Метод с использованием штриховых планшетов

Методы с использованием штриховых планшетов различаются в зависимости от количества срезов агара. В методе Т-образной полосы используются три секции: верхняя половина и две нижние секции одинакового размера. Исходный посевной материал помещают в верхнюю половину чашки. Бактерии перетаскиваются из верхней секции в одну из нижних секций, а затем из этой нижней секции в другую.В квадрантном методе штрихуются четыре участка одинакового размера.