Диффузная алопеция мкб 10: Ошибка 404. Файл не найден

Рекомендации МГНОТ по COVID-19 и постковидному синдрому 2021

8.1 Образ болезни

• Слабость утомляемость 84,5%
• Боли в мышцах, костях и суставах 63,9%
• Невозможность выполнения обычных нагрузок 60,3%
• Бессоница, сонливость днем 77,3%

• Заложенность в груди, проблемы с дыханием 36,6%
• Познабливания 51,5%
• Головные боли появились 43,8%

• Нарушение регуляции АД 55,2%

• Нарушение зрения 40,7%

• Жидкий стул 22,7%
• Высыпания на коже 25,3%
• Из них подобные высыпания бывали ранее у 28,6%
• Стали сниться необычные яркие сны 37,6%
• Узлы на венах, болезненность вен, изменный венозный рисунок 22,7%

• Нарушение походки 24,2%
• Шум в ушах, нарушение слуха 40,7%
• Боль в области сердца 43,3%

• Болит кожа 22,4%
• Потливость ночью или днем 46,9%
• Выпадение волос 41,2%
• Жжение, стягивание кожи 35,1%
• Нарушение потенции, либидо 7,2%
• Похудение 40,7%

• · Головокружения 52,6%

• Нарушение аппетита 28,4%
• Учащенное мочеиспускание 24,2%
• Увеличение и болезненность лимфоузлов 18,6%

• · Сердцебиния, нарушения ритма 63,4%

• Употребление большого количесвта кофе или чая 13%
• Ощущение неровного ритма сердца 62,6%

• · Депрессия легкая 68,6%
• · Тревога 68,6%
• · Ощущение своей вины перед другими 50,5%
• · Размышление о прошлых ошибках 51,5%
• · Суицидальные мысли 35,5%
• · Мурашки на коже 37,1%
• · Нарушение регуляции температуры тела 47,9%

• · Нарушение менструального цикла 27,7% (от женщин)

Пока нет окончательных суммированных данных о дерматологических проявлениях COVID-19 со всего мира, но есть информация из Китая, Испании, Англии и США. Всего врачи описали более 350 случаев COVID-19 c кожной симптоматикой. Первые исследования из Китая говорили о том, что кожные заболевания у пациентов с COVID-19 встречаются редко. Среди первых 1099 человек, зараженных в Ухане, только у двоих пациентов наблюдались кожные симптомы (0,2%).
Но затем частые поражения кожи заметили у пациентов отделений интенсивной терапии. Сейчас появился специальный онлайн-реестр по дерматологии нового коронавируса, где все страны могут делиться зафиксированными случаями кожных проявлений COVID-19. Его основная цель — быстро и качественно собрать медицинские сведения, которые помогут в лечении.
Поражения кожи и ее придатков при COVID-19 разнообразны (Кожные сыпи при коронавирусной инфекции COVID-19, вызванной SARS-CoV-2. Методические рекомендации N 9. ГБУЗ МНПЦДК ДЗМ, Москва 2021). Они могут появиться за несколько дней до развития инфекции, длительность изменений на коже варьирует от 1 до 14 дней. (Cutaneous manifestations associated with anosmia, ageusia and enteritis in SARS-CoV-2 infection – a possible pattern? Observational study and review of the literature.Birlutiu V, Feiereisz AI, Oprinca G, Dobritoiu S, Rotaru M, Birlutiu RM, Iancu GM.Int J Infect Dis. 2021 Apr 19:S1201-9712(21)00370-2. doi: 10.1016/j.ijid.2021.04.058., Cutaneous Manifestations in Confirmed COVID-19 Patients: A Systematic Review. Conforti C, Dianzani C, Agozzino M, Giuffrida R, Marangi GF, Meo ND, Morariu SH, Persichetti P, Segreto F, Zalaudek I, Neagu N.Biology (Basel). 2020 Dec 5;9(12):449. doi: 10.3390/biology9120449.) Аналогичные высыпания отмечаются при постковидном синдроме и длительно протекающем ковиде. У некоторых пациентов кожные проявления коронавирусной инфекции могут быть единственным проявлением вирусной инфекции. (Skin Manifestations Associated with COVID-19: Current Knowledge and Future Perspectives. Genovese G, Moltrasio C, Berti E, Marzano AV.Dermatology. 2021;237(1):1-12. doi: 10.1159/000512932.)
Выделят 6 основных клинических образов (паттернов/групп) собственно кожных проявлений и 2 – поражения придатков кожи (SARS-CoV-2, COVID-19, skin and immunology – What do we know so far? Novak N, Peng W, Naegeli MC, Galvan C, Kolm-Djamei I, Brüggen C, Cabanillas B, Schmid-Grendelmeier P, Catala A.Allergy. 2021 Mar;76(3):698-713. doi: 10.1111/all.14498.).
Группа 1. Крапивница. В некоторых случаях она может быть даже предвестником начала COVID-19. Также возможно классическое ее развитие вследствие лекарственной непереносимости. Проявляется в виде пятен розового цвета с неровными краями, локализуется преимущественно на конечностях, груди, животе, спине. Может сопровождаться отеком Квинке. Пятна до 15 мм называются розеолы, больше 20 мм – эритема. Обычно это не 1 элемент, а слияние нескольких. Больные могут ощущать сильный зуд или жжение ладоней и подошв, болезненные ощущения при прикосновении и др.

Диффузная алопеция | DermNet NZ

Автор: д-р Харриет Белл, дежурный, Оклендская городская больница, Окленд, Новая Зеландия. Главный редактор DermNet NZ: адъюнкт А / проф. Аманда Окли, дерматолог, Гамильтон, Новая Зеландия. Копия отредактирована Гасом Митчеллом. Октябрь 2019.

Что такое диффузная алопеция?

Алопеция – это медицинское слово, означающее выпадение волос. Алопеция бывает диффузной, если поражает кожу головы в целом. Это контрастирует с локализованной или очаговой алопецией, которая характеризуется неоднородным выпадением волос.

Кто заболевает диффузной алопецией?

Диффузная алопеция встречается часто, поражая до 50% мужчин и женщин. Хотя это может повлиять на оба пола в любом возрасте, женщины обращаются чаще, чем мужчины [1,2].

Волосяной цикл

Волосяные фолликулы проходят через фазы роста и покоя.

• Анаген (фаза роста) длится от двух до шести лет.
• Катаген – это короткая переходная фаза, длится от четырех до шести недель.
• Телоген (фаза покоя) длится два-три месяца и заканчивается высвобождением волос из фолликула [3,4].

Как классифицируется диффузная алопеция?

Диффузную алопецию можно разделить на состояния, вызывающие чрезмерное выпадение волос, и состояния, вызывающие истончение волос [1].

Чрезмерное выпадение волос

Аномальное выпадение волос (или выделение) может происходить во время фазы телогена или анагена цикла волос.

Телогеновое выпадение

Телогеновое выпадение является наиболее частой причиной диффузного выпадения волос [3,5]. Триггерное событие вызывает преждевременное попадание увеличенного количества волос анагена в катаген, а затем в фазу телогена.Чрезмерное выпадение телогеновых волосков происходит через несколько месяцев после триггерного события [3].

Пациенты могут заметить выпадение клочков волос на щетке для волос или во время принятия душа [6]. Может выпадать до 30–50% волос на коже головы [1]. Избыточное выпадение волос может вызвать диффузное истончение, битемпоральную рецессию или выявить характерное выпадение волос у генетически предрасположенных людей [3].

Многие триггеры участвуют в оттоке телогена; К ним относятся:

Телогеновый отток

Выпадение анагена

Отток анагена происходит, когда фаза анагена прерывается, вызывая преждевременное прекращение роста волос и резкое их выпадение.

Истечение анагена чаще всего возникает в результате химиотерапии (см. Лекарственная алопеция) и обычно начинается через одну-две недели после начала лечения. Это может привести к потере 80–90% волос на теле, включая брови и ресницы [1,2]. Это также может быть вызвано отравлением таллием, колхицином или селеном [7].

Истечение анагена также может быть вызвано очаговой алопецией [2]. Гнездная алопеция – это аутоиммунное заболевание у людей с генетической предрасположенностью, которое обычно проявляется в виде очагов выпадения волос с проплешинами (очаговая алопеция) [2,5].Сливающаяся или широко распространенная очаговая алопеция проявляется диффузным выпадением волос, иногда приводящим к полному облысению волосистой части головы (alopecia totalis) или полному облысению тела (alopecia universalis) [1,2,5].

Выделение анагена

Прореживание волос

Постепенное диффузное истончение волос происходит из-за выпадения волос по мужскому или женскому типу [1,8].

Выпадение волос по типу

Выпадение волос по мужскому типу вызвано генетической предрасположенностью, которая влияет на чувствительность волосяных фолликулов к циркулирующим андрогенам; по этой причине ее иногда называют андрогенной алопецией [1,4].Характерный узор – битемпоральная рецессия и облысение в макушке и лобной области.

Выпадение волос по женскому типу имеет сильный генетический компонент, но роль андрогенов неясна [8]. Рисунок истончается на верхней части волосистой части головы с расширением средней части [1,4].

Типичное выпадение волос у женщин происходит раньше и тяжелее при синдроме поликистозных яичников, при вирилизирующей опухоли или при воздействии экзогенного андрогена, такого как тестостерон.

Узор облысения

Каковы осложнения диффузной алопеции?

Выпадение волос оказывает минимальное вредное физическое воздействие; однако это может нанести психологический ущерб и отрицательно сказаться на качестве жизни, поскольку волосы связаны с индивидуальностью человека (см. Психологические последствия выпадения волос).Психиатрические расстройства, включая тревогу и депрессию, чаще встречаются у людей с алопецией, чем у людей без нее [6,9]. Выпадение волос на макушке кожи головы часто приводит к травмам кожи головы, поскольку волосы на коже головы служат ранним предупреждением о надвигающемся контакте.

Как диагностировать диффузную алопецию?

Диффузная алопеция – это клинический признак, наблюдаемый при осмотре. Дополнительные тесты могут использоваться для диагностики основной причины [6].

Анамнез и обследование

Анамнез может выявить триггеры или генетическую предрасположенность [6].Было показано, что женщины точно оценивают процент выпадения волос на основе изменения диаметра или окружности хвоста.

Обследование должно включать:

• Обследование кожи головы должно оценить степень и характер выпадения волос, а также признаки воспаления, покраснения, шелушения и рубцов [2].
• Необходимо оценить длину стержня, диаметр и ломкость стержня волоса [2].
• Обследование кожи головы с помощью дерматоскопа (трихоскопия) может дать дополнительную информацию (см. Дерматоскопия) [4].
• При диффузной алопеции могут наблюдаться изменения ногтей (см. Заболевания ногтей).
  • Линии Бо – это бороздка на ногте, совпадающая с моментом остановки роста волос.
  • Язвы на ногтях связаны с очаговой алопецией [6].

Анализы крови

Необходимо провести лабораторное обследование для выявления излечимых причин. Это может включать:

• Общий анализ крови и ферритин при анемии и дефиците железа
• Тесты функции щитовидной железы при заболеваниях щитовидной железы
• Уровень цинка в сыворотке крови, поскольку дефицит цинка может быть ранним признаком целиакии
• Функциональные пробы почек и печени
• Антинуклеарные антитела, если признаки указывают на системную красную волчанку
• Гормональная оценка (индекс свободного андрогена, глобулин, связывающий половые гормоны, пролактин) у женщин с клиническими признаками гиперандрогении [2–4,8].

Испытание на вытягивание волос

Испытание на вытягивание волос включает захват 40–60 близко сгруппированных волосков и осторожное вытягивание. Если легко выдергивается более 10% волос, тест положительный [3].

Трихограмма

Для трихограммы выщипывают 20-50 волос и исследуют их под микроскопом, чтобы оценить процентное содержание волос анагена и телогена.

• Нормальный результат – это> 80% волос анагена и <20% волос телогена [4].
• Телогеновый отток характеризуется 25% телогеновых волосков [3].
• Волосы с восклицательным знаком (у которых стержень волоса сужается к коже черепа, имитируя восклицательный знак) типичны для очаговой алопеции [6].

Биопсия кожи головы

Для оценки алопеции следует взять две четырехмиллиметровые пункционные биопсии из макушки черепа или там, где есть клинические признаки [5]. Важно четко обозначить форму запроса на гистологию как предназначенную для исследования алопеции, чтобы можно было разрезать одну биопсию по горизонтали для определения количества фолликулов.

• Повышенное количество телогеновых фолликулов (> 15-25%) без воспаления наблюдается в телогенном эффлювии [3,5].
• Плотный инфильтрат лимфоцитов и других иммунных клеток наблюдается в самой глубокой части волосяных фолликулов при очаговой алопеции [4].
• Миниатюризация волосяных фолликулов (когда фолликулы производят все более тонкие волосы) и низкое соотношение терминальных волос к пушковому волосу наблюдается при облысении по мужскому / женскому типу [2,8].

Каковы методы лечения и исходы диффузной алопеции?

Лечение и прогноз диффузной алопеции зависят от основной причины.

Телогеновый отток

Острый телогеновый отток проходит в течение трех-шести месяцев, а густота волос возвращается к норме, если были выявлены и прекращены прием текущих триггеров или причинных лекарств (см. Лекарственная алопеция) [5]. Однако при генетической предрасположенности может быть остаточная алопеция. Лечение обычно не требуется [6].

Выпадение волос, продолжающееся более шести месяцев, известно как хроническое телогеновое истощение. Она имеет тенденцию колебаться в течение нескольких лет, затем обычно проходит спонтанно [5].

Эфлювий анагена

Выделение анагена контролируют под наблюдением и поддержкой [2].

• Охлаждение кожи головы может уменьшить алопецию, вызванную химиотерапией (см. Кожная токсичность химиотерапевтических препаратов) [10].
• Отфлювий анагена обычно проходит после прекращения химиотерапии; перманентная алопеция встречается редко [6].

Диффузную очаговую алопецию лечить сложно. Даже если лечение вызывает усиление роста волос, выпадение волос может возобновиться после прекращения лечения [1].

Естественное течение диффузной очаговой алопеции непостоянно. Одна треть пациентов выздоравливает самопроизвольно в течение шести месяцев, и у 50–80% этих пациентов через год сохраняются стойкие волосы. У некоторых пациентов могут быть повторные эпизоды диффузной очаговой алопеции [4,9].

Новые отрастающие волосы могут быть не того же цвета или текстуры, которые были до их потери [9].

Прогноз хуже при очаговой алопеции, которая вначале является тяжелой. Менее 10% пациентов с тотальной и универсальной алопецией выздоравливают [1].

Выпадение волос по мужскому и женскому типу

Лечение типичной алопеции следует продолжать бесконечно, поскольку прекращение лечения приводит к повторной потере волос [4,6]. Лечение включает:

• Раствор миноксидила для местного применения – обычно улучшение наблюдается через 6–12 месяцев [4,6]
• Финастерид для перорального применения – применяется при облысении по мужскому типу [4]
• Антиандрогенная терапия для женщин включает пероральный прием спиронолактона, ципротерона ацетата и финастерида, но данные об эффективности ограничены [8].

Накладные волосы и парики, накладные ресницы и брови, а также цветные спреи или макияж могут использоваться для маскировки участков облысения.

Трансплантация волос может использоваться для лечения запущенного облысения по мужскому или женскому типу [4].

Диффузное выпадение волос у взрослой женщины: подход к диагностике и лечению

Телогеновый отток (ТЕ) – наиболее частая причина диффузного выпадения волос у взрослых женщин.TE, наряду с выпадением волос по женскому типу (FPHL) и хроническим телогеном (CTE), составляет большинство случаев диффузной алопеции. Резкое, быстрое и общее выпадение нормальных косолапых волос через 2-3 месяца после инициирующего события, такого как роды, высокая температура, серьезная операция и т. Д., Указывает на TE, в то время как постепенное диффузное выпадение волос с истончением центральной части кожи головы / расширением центральной линии пробора / лобно-височная рецессия указывает на FPHL. Чрезмерное, тревожное диффузное выпадение, исходящее от нормально выглядящей головы с большим количеством волосков и без очевидной причины, является отличительной чертой CTE, который отличается от TE и FPHL.Помимо общего анализа крови и стандартного исследования мочи, уровни ферритина в сыворотке и Т3, Т4 и ТТГ следует проверять во всех случаях диффузного выпадения волос без видимой причины, поскольку дефицит железа и нарушения гормонов щитовидной железы являются двумя часто связанными состояниями. с диффузным выпадением волос, и в большинстве случаев нет очевидных клинических признаков, свидетельствующих о них. CTE часто путают с FPHL, и его можно надежно дифференцировать с помощью биопсии, которая показывает нормальную гистологию CTE и миниатюризацию со значительным снижением соотношения терминальных и пушковых волос (T: V <4: 1) в FPHL.Неоднократная уверенность, поддержка и объяснение того, что состояние представляет собой чрезмерное выпадение, а не фактическую потерю волос, и не приводит к облысению, являются руководящими принципами при лечении TE, а также CTE. TE является самоограничивающимся и разрешается через 3-6 месяцев, если триггер удален или лечится, в то время как прогноз CTE менее определен и может занять 3-10 лет для спонтанного разрешения. Миноксидил 2% для местного применения с антиандрогенами или без них, финестрайд, протезирование волос, косметика для волос и хирургия волос являются терапевтически доступными вариантами для лечения FPHL.

Больничное исследование для определения причин диффузного выпадения волос у женщин

J Clin Diagn Res. 2015 Авг; 9 (8): WC01 – WC04.

Шашикант Малкуд

¹ Старший ординатор, отделение дерматологии, венерологии и лепры, Медицинский колледж ESIC, Калабураги, Карнатака, Индия.

¹ Старший ординатор, отделение дерматологии, венерологии и лепры, Медицинский колледж ESIC, Калабураги, Карнатака, Индия.

Поступило 19 марта 2015 г .; Изменения запрошены 8 апреля 2015 г .; Принято 20 мая 2015 г.

Abstract

Предпосылки

Диффузное выпадение волос – частая жалоба, с которой дерматологи сталкиваются в своей повседневной клинической практике.Выпадение волос у женщин – очень тяжелое состояние. Различные основные факторы по отдельности или в сочетании вносят свой вклад в патогенез.

Цели

Определить причины диффузного выпадения волос у женщин и найти связь между вероятными причинами и соответствующими лабораторными параметрами, где это применимо.

Материалы и методы

В исследование были включены сто восемьдесят женщин с диффузным выпадением волос. Детальный анамнез и клиническое обследование, включая тест на вытягивание волос и микроскопию волос, проводились у всех испытуемых.Были проведены специальные лабораторные исследования для определения железодефицитной анемии, дисфункции щитовидной железы и паразитарной инвазии.

Результаты

Среди 180 пациентов 116 (64,44%) имели телогеновый отток, 28 (15,55%) имели CTE, 21 (11,66%) имели FPHL и 1 (0,55%) имели AE. Четырнадцать пациентов (7,77%) имели более одного этиологического диагноза диффузного выпадения волос. TE был наиболее распространенным типом диффузного выпадения волос. Заболеваемость TE и FPHL была самой высокой в ​​возрастной группе 21-30 лет, тогда как CTE в 30-40 лет.Психологический стресс и железодефицитная анемия были наиболее частыми этиологическими факторами, лежащими в основе ТЕ, что является статистически значимым (p <0,05). Из 130 пациентов с TE более одного этиологического фактора было зарегистрировано в 10 случаях, тогда как в 32 случаях вероятные этиологические факторы не могли быть выявлены из анамнеза. Большинство случаев CTE были идиопатическими. Никакой существенной взаимосвязи между CTE, уровнем гемоглобина и уровнем ферритина в сыворотке не наблюдалось. Из 35 пациентов с FPHL низкий уровень гемоглобина наблюдался у 6/20 (30%) и низкий уровень сывороточного ферритина у 14/17 (82.35%).

Заключение

Диффузное выпадение волос – многофакторное состояние. Подробный анамнез, тщательное клиническое обследование и соответствующие обследования помогают выявить причинные факторы и соответственно лечить их.

Ключевые слова: Анагеновый отток, Хронический телогеновый отток, Выпадение волос по женскому типу, Телогеновый отток.

Введение

Волосы – это эктодермальная структура, имеющая большое косметическое значение. Это помогает человеку поддерживать самооценку и поддерживать здоровые и значимые социальные взаимодействия [1].Выпадение волос вызывает беспокойство у любого человека, независимо от возраста и пола, особенно у женщин [2]. Нормальный цикл роста волос приводит к замене каждого волоса на коже головы к 3-5 годам [3].

Волосы являются неотъемлемой частью идентичности многих женщин. Женственность, сексуальность, привлекательность и индивидуальность символически связаны с волосами женщины, а не с мужчинами. По сравнению с мужчинами из-за выпадения волос у женщин больше вероятность снижения качества жизни и ограничения социальных контактов по сравнению с мужчинами [2]. Психиатрические расстройства более распространены у пациентов с алопецией, чем у населения в целом, что позволяет предположить, что пациенты с алопецией могут иметь более высокий риск развития серьезных депрессивных эпизодов, тревожных расстройств, социальной фобии или параноидального расстройства [1].

Диффузное выпадение волос – частая жалоба дерматологов в их повседневной клинической практике [4]. Женщины обращаются с этой жалобой чаще [5]. Диффузное выпадение волос обычно происходит без воспалений и рубцов [3]. Существуют различные причины диффузного выпадения волос, в том числе выпадение телогена (TE), выпадение волос по женскому типу (FPHL), хроническое выпадение телогена (CTE), выпадение волос в анагене (AE), синдром выпадения волос в анагене и диффузный тип очаговой алопеции. Истинная частота отхождения телогена не определена должным образом из-за отсутствия данных, особенно о субклинических случаях [6–8].Хотя диффузное выпадение волос является распространенной проблемой, в Индии и других странах проведено лишь несколько исследований, изучающих причины диффузного выпадения волос [9,10].

Однако облысение не следует рассматривать только как косметическую жалобу. Это может быть указателем на различные системные заболевания, такие как анемия, гипотиреоз, гипертиреоз, хронические инфекционные заболевания и т. Д. Следовательно, определение причины диффузного выпадения волос обязательно во всех случаях [4]. Это исследование было проведено с целью выявления различных причин диффузной алопеции среди индийских женщин и их связи с соответствующими лабораторными параметрами.

Материалы и методы

Это исследование проводилось на базе больницы в период с октября 2011 года по сентябрь 2013 года. Было проведено предварительное одобрение институционального этического комитета. Были включены все девушки-подростки и женщины, обратившиеся с диффузным выпадением волос в амбулаторное отделение дерматологического отделения третичного лечебного учреждения в течение периода исследования. Пациенты с очаговой / универсальной алопецией и рубцовой алопецией были исключены.

Всего за этот период в исследование было включено 180 пациентов.Пациентам рассказали о неинвазивных методах исследования волос, которые будут использоваться во время исследования. Информированное согласие было получено от всех пациентов или родителей, в случае девочек-подростков. Подробный анамнез был взят у всех субъектов исследования с особыми запросами относительно серьезного лихорадочного заболевания, психологического стресса или любой операции и рождения ребенка в недавнем прошлом (за 3 месяца до начала выпадения волос). Также записывалась история хронической кровопотери, экстренной диеты и приема любых наркотиков.

При общеклиническом обследовании искали специфические признаки анемии, желтухи и отека щитовидной железы. При обследовании кожи головы был отмечен тип выпадения, истончения волос и временная рецессия. Всем пациентам проводились проба на вырывание волос, проба на отрыв и трихоскопия. Пациенты с FPHL были разделены на три подгруппы на основе шкалы Людвига (типы I, II и III). Тест на вытягивание волос проводился путем вытягивания 20-60 волосков между большим, указательным и средним пальцами. Тест считался положительным, если более 10% волос было оторвано от кожи головы [11].У всех пациентов были проведены лабораторные исследования, включая уровень гемоглобина, мазок периферической крови, общий анализ крови, уровень ферритина в сыворотке, тиреотропный гормон (ТТГ), Т3, Т4 и исследование кала.

Наблюдения, относящиеся к параметрам исследуемой группы, выражены в процентах. Собранные данные были представлены со средним значением ± 2SD. Для выявления связи между диффузным выпадением волос и различными лабораторными параметрами применялись критерий хи-квадрат и точный критерий Фишера.

Результаты

Всего за период исследования было обследовано 180 пациентов с диффузным выпадением волос. Из 180 пациентов 116 (64,44%) имели телогеновый отток, 28 (15,55%) имели CTE, 21 (11,66%) имели FPHL и 1 (0,55%) имели AE. Четырнадцать пациентов (7,77%) имели более одного этиологического диагноза диффузного выпадения волос. Различные клинические типы облысения в разных возрастных группах представлены в [].

[Таблица / Рис-1]:

Клинические типы облысения среди различных возрастных групп пациентов

Возраст пациентов с ТЭ варьировал от 12 до 54 лет (средний возраст 25 лет.9 ± 7,99 года). Заболеваемость TE была самой высокой в ​​возрастной группе 21-30 лет. Продолжительность выпадения волос составляет от 7 дней до 6 месяцев. Психологический стресс был наиболее частым вероятным этиологическим фактором (n = 48, p <0,05), за которым следовало предшествующее лихорадочное заболевание в 16 случаях, прием лекарств в 12 случаях, местное применение различных коммерческих продуктов для волос в 8 случаях, экстренная диета в 8 случаях, ребенок роды в 7 случаях, хроническая кровопотеря в 6 случаях, предшествующая операция в 3 случаях []. На основании анамнеза невозможно выявить вероятный этиологический фактор у 32 (24.61%) пациентов и более одного фактора зафиксировано в 10 (7,69%) случаях. При осмотре кожи головы истончение волос было выявлено у 46 (35,38%) пациентов. Проба на вырывание волос была положительной у 54 (41,53%) пациентов. Положительный тяговой тест и битемпоральная рецессия наблюдались у 13 (10%) и 16 (12,30%) пациентов соответственно. Волосы телогена при микроскопическом исследовании наблюдались у всех пациентов (100%).

[Таблица / Рис. 2]:

Вероятные этиологические причины отхождения телогена у исследуемых субъектов (на основе анамнеза)

Полная гемограмма была сделана 83 из 130 пациентов. Низкий уровень гемоглобина (<12 г / дл) наблюдался у 50/83 (60,24%) пациентов (p <0,05). При исследовании периферического мазка микроскопический гипохромный мазок выявлен у 21/83 (25.30%) пациентов, нормоцитарный гипохромный мазок у 4/83 (4,87%) пациентов, диморфная и макроцитарная анемия у каждого 1/83 (1,21%) пациента []. Уровень ферритина в сыворотке крови определялся у 74 из 130 пациентов с ТЭ. Уровень ферритина в сыворотке <70 мкг / л наблюдался у 69/74 (93,24%) пациентов (p> 0,05) []. Функциональный тест щитовидной железы был проведен 74 из 130 пациентов с ТЕ; гипертиреоз был зарегистрирован у 3/74 (4,05%) пациентов, а субклинический гипотиреоз – у 2/74 (2,70%) пациентов. Обследование кала проведено 33 пациентам; Признаки паразитарной инвазии наблюдались у 2 (6.06%) пациентов.

[Таблица / Рис-3]:

Уровень гемоглобина и результаты мазка периферической крови у пациентов с оттоком телогена, хроническим оттоком телогена и выпадением волос по женскому типу (MCHC-микроцитарная гипохромная, NCHC-нормоцитарная гипохромная, MC-макроцитарная анемия, DM – диморфная анемия, NCNC- нормоцитарная нормохромная)

[Таблица / Рис.-4]:

Уровень ферритина в сыворотке у пациентов с телогеновым выпадением, выпадением волос по женскому типу и хроническим телогеновым оттоком

Всего 35 пациентов были диагностированы как FPHL. Возраст начала облысения по женскому типу варьировал от 20 до 55 лет. Возраст пациента с FPHL I типа варьировал от 20 до 55 лет (средний возраст 28 лет.87 ± 8,81 года), а возрастной диапазон пациентов с FPHL типа II составлял от 22 до 55 лет (средний возраст 36,75 ± 8,60 лет), но ни у одного из них не было FPHL типа III. В семейном анамнезе узорчатое облысение отмечено у 14 (38,8%) пациентов. Заболеваемость FPHL была самой высокой в ​​возрастной группе от 21 до 30 лет. При обследовании битемпоральная рецессия отмечена у 3 (8,33%) пациентов. Положительный результат теста на выдергивание волос наблюдался у 13 (36,11%) пациентов. При микроскопическом исследовании телогеновые волосы были обнаружены у всех пациентов (100%).

Полная гемограмма была сделана 20 из 35 пациентов.Низкий уровень гемоглобина отмечен у 6/20 (30%) пациентов (p <0,05). Исследование мазка периферической крови показало гипохромную микроцитарную и нормоцитарную гипохромную картину у 2 (10%) пациентов []. У 17 из 35 пациентов была проведена оценка уровня ферритина в сыворотке крови. Уровень сывороточного ферритина <70 мкг / л наблюдался в 14 случаях (p> 0,05) []. Функциональный тест щитовидной железы был проведен у 17 из 35 пациентов. Биохимические признаки субклинического гипотиреоза и гипертиреоза зарегистрированы у 1 пациента.

Среди 180 пациентов с диффузным выпадением волос 28 (15.55%) пациенты были диагностированы как CTE с возрастом пациентов от 15 до 45 лет (средний возраст 26,74 года). Заболеваемость CTE была самой высокой в ​​возрастной группе 30-40 лет. Из 28 пациентов с ХТР 5 сообщили в анамнезе о возможных этиологических причинах ХТР. Это были прием лекарств (n = 1, 3,57%), диабет (n = 2, 7,14%), белковая энергетическая недостаточность (n = 1, 3,57%) и дефицит цинка (n = 1, 3,57%).

При осмотре кожи головы истончение волос было отмечено у 5 (17,8%) пациентов, а рецессия битемпорала – у 5 (17.85%) пациентов. Проба на вырывание волос была положительной у 10 (35,71%) пациентов. Полная гемограмма была сделана 20 из 28 пациентов; низкий уровень гемоглобина (<12 г / дл) наблюдался у 10 пациентов (p> 0,05). При исследовании мазка периферической крови микроцитарная гипохромная анемия была выявлена ​​у 5 пациентов, а нормоцитарная гипохромная анемия – у 2 пациентов []. Уровень ферритина в сыворотке крови был оценен у 17 из 28 пациентов. Уровень ферритина в сыворотке <70 мкг / л наблюдался в 12 случаях (p> 0,05) []. Функциональный тест щитовидной железы был проведен у 17 из 28 пациентов, но все они оказались эутиреоидными.Один из 180 пациентов поступил с НЯ. Она получала химиотерапию (циклофосфамид, адриамицин, 5-флуроурацил) по поводу рака груди. При осмотре тест на выдергивание волос и тест на перетягивание дали положительные результаты. При микроскопическом исследовании наблюдались дистрофические волосы анагена.

Обсуждение

Дерматологи часто сталкиваются с проблемами волос в повседневной практике. Выпадение волос практически не имеет вредных для здоровья последствий или вообще не имеет, но может привести к психологическим последствиям, включая высокий уровень беспокойства и депрессии [12].Выпадение волос – распространенное заболевание, распространенность которого оценивается в 1,7% в течение всей жизни; однако эта цифра не является надежной оценкой, так как по этому поводу опубликовано очень мало эпидемиологических исследований, отчасти из-за занижения данных [1].

Связь низкого уровня ферритина в сыворотке и выпадения волос обсуждалась на протяжении многих лет. Существуют разногласия по поводу порогового уровня сывороточного ферритина, ниже которого его можно определить как дефицит питательных веществ, вызывающий выпадение волос [13]. Ферритин сыворотки напрямую связан с внутриклеточным ферритином и, следовательно, с общими запасами железа в организме.Только дефицит железа вызывает очень низкие концентрации ферритина в сыворотке; поэтому низкая концентрация ферритина очень специфична для дефицита железа [14].

Используя уровень ферритина в сыворотке в качестве маркера дефицита накопления железа, определение дефицита железа (но не конкретно железодефицитной анемии) в различных исследованиях варьировалось от уровня ферритина в сыворотке от ≤15 мкг / л до <70 мкг / л. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), анемия определяется как уровень сывороточного гемоглобина <12 г / дл [15].

Telogen effluvium

Из 180 пациентов 116 были диагностированы как TE и 14 были TE с FPHL []. Jain et al. Изучили 100 случаев диффузного выпадения волос и наблюдали TE в 92% случаев; лихорадочное заболевание было наиболее частой причиной (33%) [9]. В настоящем исследовании психологический стресс был наиболее частой причиной ТЕ (36,92%), и между этими двумя переменными была статистически значимая связь (p <0,05). Rustom et al. Изучили 50 случаев TE и также обнаружили, что психологический стресс был наиболее частой первопричиной (42%) [10].В их исследовании низкий уровень гемоглобина был зарегистрирован в 50% случаев с ТЕ [10]; в настоящем исследовании он был обнаружен у 60,24% пациентов, и между этими двумя переменными была статистически значимая связь (p <0,05). При обычном осмотре кала паразитарная инвазия желудочно-кишечного тракта была обнаружена в 12 случаях в вышеупомянутом исследовании [10]. В настоящем исследовании паразитарные инвазии наблюдались в 2 случаях. Авторы не указали сопутствующий прием лекарств или эндокринопатию как этиологический фактор ТЕ, тогда как в настоящем исследовании прием лекарств, гипертиреоз и гипотиреоз встречались как вероятные причины телогенного истощения у 9 пациентов.23%, 4,05% и 2,70% случаев соответственно. Основываясь на анамнезе, Rustom et al. Не смогли найти никаких вероятных этиологических причин диффузного выпадения волос у 30% пациентов [10]; по сравнению с настоящим исследованием, где у 24,61% пациентов не было анамнеза, относящегося к вероятным причинам ТЕ.

Случай телогенного истощения с полным наложением выпавших волос

В проспективном когортном исследовании, проведенном Sinclair R, у 194 женщин в возрасте от 11 до 72 лет с TE у 12 (6%) был обнаружен уровень ферритина в сыворотке ≤ 20 мкг / л [13].У всех этих пациентов концентрация гемоглобина была нормальной [13]. В настоящем исследовании уровень ферритина в сыворотке <70 мкг / л наблюдался у 69 из 74 пациентов, что было статистически недостоверным (p> 0,05). Kantor et al. Сравнили уровень ферритина в сыворотке у пациенток с выпадением волос различной этиологии, например, телогеновой алопецией, андрогенной алопецией, гнездной алопецией и тотальной / универсальной алопецией, со здоровой контрольной группой [16]. Средние уровни ферритина в сыворотке были ниже у субъектов с андрогенетической алопецией и очаговой алопецией по сравнению со здоровыми контрольными субъектами, но не так по сравнению с пациентами с TE или алопецией totalis / universalis [16].

Выпадение волос по женскому типу

Менее 45% женщин всю жизнь имеют волосы на голове [2]. FPHL характеризуется уменьшением густоты волос на макушке и лобной части головы с сохранением передней линии волос. Распространенность FPHL увеличивается с возрастом. Пострадавшие женщины могут испытывать психологический стресс и нарушение социального взаимодействия. В большинстве случаев диагноз может быть поставлен клинически и возможно лечение.

Из 180 пациентов 21 был диагностирован как FPHL, а у 14 был FPHL с TE.Среди них 15 пациентов имели тип I и 20 пациентов – FPHL типа II. Gan et al. Отметили увеличение распространенности FPHL с возрастом, примерно с 12% среди женщин в возрасте от 20 до 29 лет до более 50% среди женщин старше 80 лет [17]. В исследовании Birch et al., В котором участвовали 337 женщин в возрасте 18–99 лет, которые обратились в клинику общей дерматологии с другими жалобами, у 6% женщин в возрасте до 50 лет был диагностирован FPHL [18]. Заболеваемость увеличилась до 38% у женщин старше 70 лет [18].В отличие от вышеупомянутых исследований, настоящее исследование регистрирует более низкую частоту FPHL в старшей возрастной группе. Это может быть связано со снижением обеспокоенности по поводу выпадения волос в старшей возрастной группе этой группы населения, которая в основном проживает в сельской местности. Средний возраст начала FPHL в нашем исследовании составлял 31,60 года по сравнению с 34,4 года, сообщенными Zhang et al. [19]. FPHL типа III или степени 5 по Синклеру является тяжелой формой, которая встречается редко и поражает менее 1% женщин [2]. В нашем исследовании мы не зарегистрировали ни одного случая FPHL типа III.В исследовании с участием 60 пациенток с узорным облысением семейный анамнез андрогенетической алопеции среди мужчин присутствовал у 27/60 (45%) пациентов [19]; В настоящем исследовании такой анамнез отмечен у 14 из 35 (38,8%) пациентов. Средняя продолжительность выпадения волос у наших пациентов составила 1,5 года по сравнению с 4,49 года в другом исследовании [19].

Низкий уровень гемоглобина (<12 г / дл) был зарегистрирован у 6/20 (30%) пациентов в настоящем исследовании по сравнению с 8,3% в другом исследовании [19]. Только 2/20 пациентов показали микроскопический гипохромный мазок периферической крови в настоящем исследовании.Из 17 пациентов у 2 была дисфункция щитовидной железы, из которых у одного был субклинический гипотиреоз, а у другого - гипертиреоз. В исследовании Zhang et al. Из 17 пациентов с FPHL небольшое отклонение уровня ТТГ было зарегистрировано у 2 (11,76%) пациентов, но уровни T3, T4 были в пределах нормы [19].

В этом исследовании пациенты были разделены на 4 группы в зависимости от уровня ферритина в сыворотке крови:

• <12 мкг / л (дефицит железа)

• 12-20 мкг / л (истощение запасов железа)

• 20- 70 мкг / л (уровень ферритина в сыворотке ниже, чем требуется для нормального цикла волос)

• > 70 мкг / л (нормальный уровень ферритина)

Уровни ферритина в сыворотке были оценены у 17 из 35 пациентов с FPHL.У четырнадцати (82,35%) из этих 17 пациентов уровень ферритина в сыворотке был <70 мкг / л. Это выше по сравнению с результатами исследования Zhang et al. [19], где только у 35% пациентов с FPHL уровень ферритина в сыворотке был <70 мкг / л. В нашем исследовании мы не обнаружили значительной связи между FPHL и уровнем ферритина в сыворотке. Это похоже на результаты исследования Zhang et al. [19]. Olsen et al. Изучили 285 женщин с FPHL, из которых 215 (75,4%) показали уровень ферритина в сыворотке <70 мкг / л [14] по сравнению с 82.35% в нашем исследовании. Средний уровень гемоглобина и ферритина в сыворотке составлял 11,2 г / дл и 36,11 мкг / л соответственно по сравнению со значениями 13,64 г / дл и 61,01 мкг / л в исследовании Olsen et al. [14].

В другом исследовании «случай-контроль», проведенном Aydingoz et al., Авторы сравнили 10 женщин с FPHL и 46 здоровых людей из контрольной группы [20]. Не было различий в распространенности истощенных запасов железа или железодефицитной анемии в обеих группах.

Хронический телогеновый отток

ХТР – это диффузная генерализованная форма облысения неизвестной причины, которая часто встречается у женщин среднего возраста.Он поражает всю кожу головы, часто начинается внезапно и вызывает тревогу у пациента из-за выпадения большого количества волосков [21]. В настоящем исследовании из 180 пациентов с диффузным выпадением волос у 28 был диагностирован КТР. Продолжительность облысения у этих пациентов варьировала от 6 месяцев до 8 лет. Заболеваемость CTE была самой высокой в ​​возрастной группе 31-40 (46,42%) лет. Чаще всего страдали женщины в пременопаузе (96,4%), в отличие от исследования Гарсиа-Эрнандес, в котором это преимущественно наблюдалось у женщин в постменопаузе (67%) [21].Olsen et al. Изучили 96 женщин с CTE, из которых 58 (60%) находились в пременопаузе, а 38 (40%) – в постменопаузе [14].

В этом исследовании вероятными этиологическими причинами CTE, основанными на анамнезе, были прием лекарств у 1 (3,57%) пациента, диабет у 2 (7,14%) пациентов, белковая энергетическая недостаточность у 1 (3,57%) пациента и дефицит цинка у 1 (3,57%) пациент. При осмотре кожи головы истончение волос было отмечено у 5 (17,8%) пациентов, битемпоральная рецессия – у 5 (17,85%) пациентов, проба на вырывание волос была положительной у 10 (35.71%) пациентов.

Из 28 пациентов с ХТР в этом исследовании 20 прошли оценку гемоглобина, и у 10 (50%) из них был обнаружен низкий уровень (<12 г / дл), который не был статистически значимым (p> 0,05). Уровень ферритина в сыворотке был оценен у 17 пациентов, и у 15 пациентов уровень ферритина в сыворотке был <70 мкг / л, что было статистически недостоверным (p> 0,05). В исследовании Olsen et al. [14] 72 из 96 (75%) пациентов имели уровень ферритина в сыворотке <70 мкг / л по сравнению с 88,23% пациентов в нашем исследовании.Средний уровень ферритина в сыворотке у пациентов с ХТР в нашем исследовании составлял 39,39 мкг / л по сравнению с 51,81 мкг / л в исследовании Olsen et al. [14]. Раштон и др. Изучили 200 женщин с ХТР, из которых 95% имели уровень ферритина в сыворотке менее 70 мкг / л [22]. Профиль щитовидной железы был также выполнен у 17 из 28 пациентов в нашем исследовании и не показал отклонений от нормы.

Анагеновый отток

При НЯ выпадение волос обычно начинается через 1-3 недели после начала химиотерапии. Степень выпадения волос зависит от пути, а также от дозы и частоты приема лекарств.Из-за длительной фазы анагена кожа головы является наиболее частым местом выпадения волос, в то время как другие терминальные волосы страдают по-разному в зависимости от процента волос в фазе анагена. АЭ обычно обратимы [23].

Из 180 пациентов только у одного была диагностирована НЯ []. Пациентка была начата с циклофосфамида, адриамицина и 5-флуроурацила по поводу рака груди. Через 3 недели после начала химиотерапии она заметила выпадение волос. При осмотре кожи головы выявлено диффузное выпадение волос.При микроскопическом исследовании наблюдались дистрофические волосы анагена []. Критерии Всемирной организации здравоохранения для анагена: степень 0 = отсутствие выпадения, степень 1 = умеренное выпадение волос и степень 2 = выраженное или полное выпадение волос. Согласно критериям ВОЗ, данный случай относился ко второй степени [23].

Случай анагенного выпадения через 3 недели после начала химиотерапии карциномы груди

Микрофотография, показывающая выпадение волос анагена (10X), в случае анагенного выпадения

Заключение

Распространенным клиническим состоянием является диффузное выпадение волос.Диагноз может быть установлен на основании анамнеза, с особым акцентом на хронологию событий, осмотра выпавших луковиц и нескольких простых скрининговых лабораторных тестов. После установления диагноза соответствующее лечение в соответствии с диагнозом может остановить выпадение волос во всех случаях, кроме CTE. Однако пациенты с CTE могут быть уверены, что состояние не прогрессирует и самоограничивается.

Примечания

Финансовые или другие конкурирующие интересы

Нет.

Список литературы

[15] Всемирная организация здравоохранения. Железодефицитная анемия: оценка, профилактика и контроль. Гевева: ВОЗ; 2001.

Введение

Гомеостаз кожи – это сложный процесс, в котором эпидермальные стволовые клетки (SC) самообновляются и генерируют дочерние клетки, которые пролиферируют, подвергаются терминальной дифференцировке и в конечном итоге умирают. Среди генов, регулирующих эпидермальный гомеостаз, мы ранее описали роль гена Tcl1a на мышиной модели [1]. TCL1A был первоначально выделен как онкоген, участвующий в T-PLL человека, и широко изучается на B-CLL [2-8], хотя у мышей Tcl1 – / – обнаруживается легкое нарушение дифференцировки B- и T-клеток [9]. .Сверхэкспрессия TCL1A при раке или на моделях мышей тесно связана с условиями пролиферации / выживания [10–12]. Кроме того, TCL1 влияет на баланс пролиферации / дифференцировки, способность к самообновлению и плюрипотентность эмбриональных стволовых клеток мыши (ESC) [13–18], и он высоко экспрессируется в предимплантационном эмбрионе, позволяя прогрессировать за пределы 4-клеточной стадии. [19, 20].

В нашем предыдущем исследовании мы показали, что TCL1 влияет как на рост волос, так и на целостность эпидермиса [1].Мы обнаружили, что потеря Tcl1a привела к нарушению пролиферации транзиторных амплифицирующих (ТА) клеток в фазе регенерации волосяного фолликула и к отсутствию экспрессии SC-маркера CD34 в выпуклости (т. Е. В SC-нише), что повлияло на способность включать BrdU в SC с медленным циклом и в клетки TA. Кроме того, было обнаружено, что Tcl1a экспрессируется в базальном слое эпидермиса мыши, где его потеря вызывает дисбаланс дифференцировки / пролиферации, что приводит к аберрантной совместной экспрессии маркеров пролиферации и апоптоза в одной и той же клетке.Как следствие, у взрослых мышей Tcl1 – / – развиваются дефекты кожи, представленные ранней алопецией и поздними изъязвлениями. Интересно, что мутантный фенотип почти полностью устраняется сверхэкспрессией TCL1A, управляемой эпидермальным промотором K14, in vivo [1].

TCL1, как известно, усиливает фосфорилирование AKT Ser-473 и его ядерную транслокацию как у людей, так и у мышей [21-24]. Кроме того, TCL1 действует как активатор NFkB через взаимодействие с p300 и как ингибитор AP1-зависимой транскрипции через прямое взаимодействие с cFOS и cJUN [25].

В этом исследовании мы использовали анализ профиля экспрессии генов (GEP), чтобы раскрыть пути, на которые влияет потеря функции Tcl1a в эпидермальных кератиноцитах (KCs), сравнивая модели Tcl1 – / – и мыши WT. Кроме того, мы оценили реактивацию TCL1 в базальном слое эпидермиса на мышиной модели K14-TCL1 на предмет его способности спасать аберрантный фенотип как на молекулярном, так и на функциональном уровнях. Мы особенно сосредоточились на функциях пролиферации / дифференцировки / апоптоза, и наши результаты показывают, что TCL1 влияет на несколько путей, индуцированных фактором роста, в результате чего путь RAS-MAPK сильно задействован.В частности, мы обнаружили, что TCL1 важен для индуцированной IGF1 пролиферации первичных KC и для их клоногенной способности. Кроме того, расщепление белков, связанных с апоптозом, таких как каспаза 3 (CASP3) и поли (АДФ-рибоза) полимераза 1 (PARP1), увеличивается в Tcl1 – / – KC. Также описаны изменения в паттерне экспрессии маркеров дифференцировки, таких как KRT6, FLG и IVL. Интересно, что восстановление экспрессии TCL1A в модели мышей K14-TCL1 почти полностью меняет аберрантный фенотип.

мышей дикого типа C57bl / 6 (WT), Tcl1 – / – и K14-TCL1; Tcl1 – / – (K14-TCL1) [1]. Все экспериментальные процедуры, уход за животными и условия содержания соответствовали европейским (Директива 86/609 / ECC и 2010/63 / UE) и итальянским (DL 116/92 и DL 26/2014) законам об использовании животных в научных исследованиях. одобрен Комитетом по уходу и использованию животных IDI-IRCCS «Organismo Preposto al Benessere Animale» (OPBA), а протокол был одобрен Министерством здравоохранения Италии.Были приложены все усилия, чтобы минимизировать страдания.

Для экспериментов по экспрессии генов собирали участки кожи размером 1 см ² через три дня после депиляции (3dpd). Биопсию кожи вырезали и помещали в PBS, содержащий 1 ед. / Мл диспазы (BD Biosciences, Бельгия), и инкубировали в течение ночи при 4 ° C при небольших колебаниях. Затем эпидермальный лист отделяли от дермы стерильным пинцетом и помещали в 1 мл реагента ТРИЗОЛ (Life Technologies, Великобритания). Тотальную РНК экстрагировали в соответствии с протоколом производителя.Качество РНК проверяли с помощью агарозного геля, и количественное определение производили с помощью спектрофотометра NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, Массачусетс, США).

Были приготовлены биотинилированные кРНК-зонды и гибридизованы с пангеномными матрицами Affymetrix Mouse Genome 430 2.0 в соответствии с протоколом производителя (Affymetrix, Санта-Клара, Калифорния, США). Для каждого генотипа использовали три животных и три независимых чипа. Неконтролируемый иерархический анализ проводился с использованием программного обеспечения BRB-Array Tools (Отдел биометрических исследований, Национальный институт рака) [26] и программного обеспечения Partek Genomic Suites (Partek Inc.Сент-Луис, Миссури, США) для анализа главных компонент (PCA). Для идентификации генов, которые по-разному экспрессировались в группах WT, Tcl1 – / – и K14-TCL1, был проведен контролируемый анализ с использованием «инструментов сравнения классов» инструментов набора BRB. К отфильтрованным наборам данных применялась модель случайной дисперсии. Гены со значениями p менее 0,001 считались статистически значимыми. Более того, гены были исключены, если их экспрессия была менее чем в 1,4 раза ниже медианного значения гена, по крайней мере, в 20% образцов.Уровень ложных открытий (FDR) также оценивался для каждого гена с использованием метода Бенджамини и Хохберга для контроля ложноположительных результатов [27]. Онтология генов (GO) и анализ путей использовали двухвыборочные t-тесты и модель случайной дисперсии. Значимые наборы генов были обнаружены с помощью теста перестановки LS / KS и теста GSA maxmean Эфрона-Тибширани. Для категорий генов, идентифицированных GO, порог был P <0,005. Для анализа путей порог определения значимых наборов генов был P <0,05. Наборы генов определены в Biocarta Pathway (https: // cgap.nci.nih.gov/Pathways/BioCarta). Анализ путей и GO был выполнен с использованием инструмента «Сравнение экспрессии набора генов» инструментов набора BRB. Согласно политике доступности данных PLOS, данные микрочипов депонируются в GEO (инвентарный номер GSE118345).

Количественное определение целевых мРНК в реальном времени относительно мРНК РНК-полимеразы II (RPII) проводили с помощью набора SYBR Green 2X SensiMix One-Step Kits (Quantace, Великобритания) с использованием системы обнаружения ABI PRISM 7000 (Applied Biosystems, Великобритания). .кДНК получали с использованием 1 мкг общей РНК, 0,5 мкг олиго dT, 1 мкл обратной транскриптазы ImProm-II (Promega, WI, США). 3 мкл кДНК, разведенной 1: 7, добавляли в 25 мкл общей реакционной смеси. Праймеры для генов-мишеней (Krt6; cFos; Gjb2; Dio2; Dusp1; Epgn; Rptn; S100a9; Sprr1b; Stk25) и эталонного гена (RPII) (MWG, Biotech, Германия) были оптимизированы для конечной концентрации 50 нМ и перечислены в Таблица S1. Был использован следующий протокол экспериментального запуска: начальная денатурация 95 ° C в течение 10 минут, затем 40 циклов денатурации 95 ° C в течение 15 секунд и отжиг при 60 ° C в течение 1 минуты.Продукты RT-PCR, проанализированные с помощью гель-электрофореза, дали один продукт ожидаемой длины. Кроме того, был проведен анализ кривой плавления, который подтвердил специфичность реакции и отсутствие димеров праймеров. Относительную экспрессию генов определяли количественно, как описано в Пользовательском бюллетене № 2 для ABI PRISM 7000.

KC мышей выделяли из кожи новорожденных мышей, как описано [28], за исключением того, что эпидермис диссоциировал после добавления 0,05% ДНКазы (Sigma-Aldrich, Италия).5 клеток в 5 мл среды.

Анализ киназы AKT проводили в соответствии с инструкциями производителя (CycLex CY-1168, MBL, Япония). Вкратце, равные количества экстракта кератиноцитов добавляли в лунки планшета вместе с АТФ-содержащим киназным реакционным буфером. После 60 минут инкубации лунки промывали и затем инкубировали с антителом, конъюгированным с HRP, в течение дополнительных 60 минут. После промывания лунки инкубировали с реагентом субстрата в течение 10 минут. Наконец, добавляли стоп-раствор и измеряли оптическую плотность с использованием планшет-ридера при двух длинах волн 450/540 нм (модель BIO-RAD 680).

1-см ² образца эпидермиса получали, как описано для выделения РНК, лизировали в буфере RIPA и кипятили в буфере для образцов SDS. 30 мкг белка разделяли в гелях SDS-PAGE и переносили на нитроцеллюлозные мембраны (BIO-RAD). Мембраны инкубировали в течение ночи при 4 ° C с первичными антителами с последующей 1-часовой инкубацией при комнатной температуре с соответствующими вторичными антителами, конъюгированными с HRP (Santa Cruz Biotechnology). Иммунообнаружение было усилено реагентами для обнаружения хемилюминесценции (Thermo Scientific Pierce).Пленки сканировали на денситометре с калиброванным изображением GS710 и оптическую плотность полос измеряли с помощью программного обеспечения Quantity One версии 4.1.1 (BIO-RAD). Используемые антитела перечислены в таблице S2.

Биопсии кожи размером 1 см ² вырезали 3dpd, заливали в криостатную среду Killik (Bio-Optica) и быстро замораживали. Срезы размером 5 мкм были разрезаны, обработаны, как описано [1], и инкубированы в течение ночи при 4 ° C с анти-TCL1 (крысиное моноклональное антитело 5A4 от Areta International), анти-фосфо-AKT (9271 Cell Signaling Technology), анти-cFOS (PC38 Calbiochem. -MERK), анти-cJUN (610326 BD biosciences), анти-фосфо-cJUN (3270 Cell Signaling Technology), анти-KRT6A (PRB-169P) или анти-KRT10 (PRB-159P Covance-Biolegend).Вторичные антитела, конъюгированные с FITC, CY3 или CY5, были получены от Jackson ImmunoResearch. Образцы наблюдали с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии с использованием микроскопа Zeiss LSM 510 Meta.

Свежевыделенные KCs низкой плотности высевали в 6-луночные планшеты (500 клеток / лунку в трех экземплярах) и культивировали в течение двух недель. Затем клетки фиксировали 2% параформальдегидом в течение 15 минут и окрашивали 1,5% родамином B в воде в течение 20 минут. Подсчитывали колонии и наносили на график среднее количество трех независимых экспериментов.Кроме того, для каждого пассажа рассчитывали процент от общего числа колоний, образовавшихся из Tcl1 – / -, по отношению к клеткам WT или K14-TCL1.

Криоконсервированные KC p0 высевали в колбу для культивирования клеток Т25. При пассаже p1 0,5 × 10 ^{4 клетки} высевали в 96-луночные планшеты в трех повторностях. Субконфлюэнтные клетки голодали в течение 16 часов в базальной среде Cnt-57 (CELLnTEC, Швейцария), а затем культивировали либо с 100 нг мл ^-1 рекомбинантного мышиного IGF-1 (Peprotech, Великобритания) в базальной среде, только в базовой среде или полная среда.Через 24 часа клетки фиксировали 3% формальдегидом в PBS, затем промывали и окрашивали 0,5% раствором кристаллического фиолетового в течение 30 минут при комнатной температуре. Образцы элюировали 100 мкл 0,1 М цитрата натрия в 50% этаноле, pH 4,2, и оптическую плотность (OD) измеряли при 595 нм с использованием считывающего устройства для микропланшетов BIO-RAD Model 680. Для каждой обработки различия в пролиферации клеток между тремя генотипы оценивали как отношение значений OD по сравнению с WT. Кроме того, влияние различных обработок на пролиферацию оценивалось для каждого генотипа как отношение OD полностью обработанного или обработанного IGF1 к базальному значению.

Статистический анализ выполняли с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 6. Для анализов CFE и пролиферации статистическую значимость определяли с помощью множественного Т-теста с использованием метода Холма-Сидака с альфа = 5.000%. Для анализа вестерн-блоттингом значимость рассчитывалась с помощью парного Т-теста. Эксперименты по экспрессии генов анализировали, как описано в параграфе «Профиль экспрессии микроматрицы» этого раздела.

. Геном 430 2.0 для генерации GEP эпидермальных KCs, полученных из моделей мышей WT, Tcl1 – / – и K14-TCL1 [1].

трех групп с использованием программного обеспечения Partek, выявляет четко различимую кластеризацию между ними (рис. 1A), подтверждая главную роль для Tcl1a в эпидермисе. Более того, неконтролируемый иерархический кластерный анализ с использованием программного обеспечения BRB показывает, что GEP мышей, несущих трансген K14-TCL1, больше похож на WT, чем на Tcl1 – / – один (Рис. 1B).Контролируемый анализ сформировал список из 271 гена, дифференциально экспрессируемого между KC WT, Tcl1 – / – и K14-TCL1 (таблица S3, P <0,001). Сравнение двух выборок было также выполнено у мышей WT против Tcl1 - / -, WT против K14-TCL1 и Tcl1 - / - против мышей K14-TCL1 (таблицы S4 – S6, соответственно). Результаты экспериментов по экспрессии генов были подтверждены с помощью ПЦР в реальном времени для 10 генов, случайным образом выбранных среди наиболее регулируемых или недостаточно регулируемых (таблица S1).

(A) PCA, проведенный Partek GS по совокупности генов, показывает, что образцы K14-TCL1 (TG, синие сферы), Tcl1 – / – (KO, красные сферы) и WT (зеленые сферы) остаются как три хорошо- отдельные группы. (B) Неконтролируемый иерархический анализ с помощью R наиболее значимых дифференциально экспрессируемых генов (31 ген, P <1e-07) показывает, что KC K14-TCL1 больше похожи на WT, чем на Tcl1 - / -. (C) Процент «спасенных» и «не спасенных» генов в KC K14-TCL1 среди 93 наиболее значимых и наиболее дифференциально экспрессируемых генов между Tcl1 - / - и KC WT.См. Текст для дальнейшего объяснения.

Чтобы оценить, в какой степени восстановление экспрессии TCL1A в базальных KCs способно спасти Tcl1 – / – GEP на уровне WT, мы выполнили общий анализ генов, перечисленных в таблице S3. Мы отнесли каждый ген к группе «спасенных» или «не спасенных» (рис. 1C) на основании следующих критериев: во-первых, мы ограничили анализ 93 генами с оценкой FDR ниже 1,00e-05 и кратным изменением. (FC) больше 1,5 или меньше 0.75 относительно отношения Tcl1 – / – к WT; во-вторых, на основе попарной значимости мы считали «спасенными» гены, которые существенно не различались между KC WT и K14-TCL1, указывая на то, что они были возвращены на физиологическом уровне, и «не спасли» гены, которые существенно не различались между Tcl1 – / – и K14-TCL1 (16 и 15 генов соответственно). Дополнительные 20 генов считались «спасенными», поскольку их экспрессия была возвращена в K14-TCL1 по сравнению с Tcl1 – / -, хотя и чрезмерно, по сравнению с WT, скорее всего, из-за сверхэкспрессии трансгена.Остальные 42 гена экспрессируются в KC K14-TCL1 на промежуточном уровне между WT и Tcl1 – / -. Среди них мы произвольно считали экспрессию генов K14-TCL1 KCs ’« достаточно »подобной WT, когда отношение к WT было ниже, чем отношение к Tcl1 – / -. В последнем столбце таблицы S3 указано отнесение каждого гена к соответствующей группе. Эти данные указывают на то, что потеря Tcl1a влияет на экспрессию нескольких генов в эпидермисе мыши и восстановление экспрессии TCL1A в базальном слое, чтобы спасти 55% этих генов (рис. 1C).

GO, а анализ путей был использован для исследования биологических механизмов, на которые может влиять потеря или усиление функции Tcl1a. GO анализ проводился с порогом значимости 0,005 для наборов генов. Среди терминов GO мы сосредоточились на тех, которые преобладают в наборах генов сверхэкспрессированных или недостаточно экспрессируемых генов (≥80%, серые отмечены в таблицах S7 – S9). Анализ показал, что мыши Tcl1 – / – дефектны по отношению к WT в дифференцировке кератиноцитов, развитии эпителия и компонентах цитоскелета, а также в процессе митоза.Напротив, гены, участвующие в процессинге антигена, сверхэкспрессируются у Tcl1 – / – по сравнению с WT (таблица S7). Интересно, что когда мышей K14-TCL1 сравнивают с WT, дефекты дифференцировки, развития и митоза больше не обнаруживаются. Избыточно представленные гены в основном участвуют в ответе на стимулы, организации актина и перемещении. Небольшое увеличение презентации антигена все еще наблюдается, даже если FC аннотированных генов все, кроме одного, ниже 1,15 (таблица S8). Сравнение мутантных и трансгенных мышей поразительно напоминало сравнение Tcl1 – / – и WT, за исключением подавления митоза (таблица S9).Путем анализа путей мы определили наборы генов, которые были значительно нарушены (P <0,05). Полные списки измененных путей у WT по сравнению с Tcl1 - / -, WT по сравнению с K14-TCL1 и Tcl1 - / - по сравнению с K14-TCL1 приведены в приложении (таблицы S10 – S12, соответственно). Сосредоточившись на тех, которые участвуют в регуляции пролиферации, дифференцировки и выживания, большинство измененных путей относятся к передаче сигналов факторов роста (IGF1, EGF, PDGF, NGF), с каскадом MAPK / AP1, который также участвует (таблицы 1, 2 и 3, соответственно) .

Эти данные убедительно подтверждают с молекулярной точки зрения функциональные дефекты, наблюдаемые в Tcl1 – / – и устраненные у мышей K14-TCL1 in vivo [1], и указывают на фактор роста и передачу сигналов MAPK среди основных молекулярная дерегуляция из-за потери Tcl1a.

Ранее мы обнаружили отсутствие пролиферирующих клеток TA и прогрессирующую потерю SCs CD34 + в волосяных фолликулах [1].Воспользовавшись данными об экспрессии генов, описанными выше, мы исследовали количество клеток-предшественников в первичных KCs, выделенных от Tcl1 – / – и от мышей K14-TCL1, по сравнению с WT, с помощью анализа колониеобразующей эффективности (CFE) (рис. 2A). Вскоре после выделения (p0) Tcl1 – / – KCs дали 49% _{+/- 18} и 58% _{+/- 22} общего числа колоний по сравнению с клетками WT и K14-TCL1, соответственно, хотя эти различия не были значительными. Различия стали заметными при первом пассаже (p1), поскольку колонии Tcl1 – / – стали 12% _{+/- 5} и 15% _{+/- 7} WT и K14-TCL1, соответственно.В самом деле, Tcl1 – / – KCs не показали никаких изменений в их CFE или имели небольшие изменения, в то время как WT и K14-TCL1 показали свой пик. На p2 разница в CFE между TCL1-нулевыми и TCL1-экспрессирующими клетками была уменьшена, но все еще значима (34% _{+/- 6} и 25% _{+/- 4} WT и K14-TCL1, соответственно). После этого значения CFE для трех разных типов клеток стремятся к 0 аналогичным образом (анализ CFE проводился до p10, не показано).

(A) Анализ CFE, проведенный на первых трех пассажах KC WT (кружки), Tcl1 – / – (квадраты) и K14-TCL1; Tcl1 – / – (треугольники вниз) мыши; значения выражены как общее количество колоний; CFE WT и K14-TCL1 значительно различаются по отношению к Tcl1 – / – на пассажах p1 и p2 (* P <0,001; ** P <0,005). (B) Пролиферация в культивируемых KC от мышей WT (темно-серый), Tcl1 - / - (черный) или K14-TCL1 (светло-серый). KC на пассаже p1 культивировали в основной среде, в полной среде или в основной среде плюс 100 нг мл ^-1 IGF-1; Приведены значения OD.Все эксперименты проводили в трех экземплярах. Отмечены достоверные различия в росте между группами (* P <0,001; ** P <0,005).

Кроме того, мы проанализировали скорость роста KC в трех генотипах (рис. 2B). При пассаже p1 KC культивировали в основной или полной среде в течение 24 часов. В базальной среде клетки мышей Tcl1 – / – росли меньше, чем клетки дикого типа (изменение 0,53 _{+/- 0,02} раз, P <0,005), тогда как в клетках K14-TCL1 дефект был менее серьезным (0,73 _{+ / -0,18} -кратное изменение, незначительное).При культивировании KC в полной среде скорость пролиферации клеток WT увеличивалась примерно в два раза, как и у клеток K14-TCL1 (1,92 _{+/- 0,13} – и 2,18 _{+/- 0,14} -кратное изменение соответственно), в то время как Tcl1- / – клетки показали значительно меньшее увеличение (1,31 _{+/- 0,17} -кратное изменение) (фиг. 2B). Наши данные GEP показали, что путь IGF1 является одним из наиболее измененных у мышей Tcl1 – / – по сравнению с WT (Таблица 1). Поскольку известно, что IGF1 регулирует эпидермальную пролиферацию [29, 30], мы протестировали его способность стимулировать KC в отношении базального состояния среды.Мы обнаружили аналогичный прирост пролиферации в клетках WT и K14-TCL1 (1,62 _{+/- 0,06} – и 1,4 _{+/- 0,07} -кратное изменение, соответственно), в то время как Tcl1 – / – клетки полностью не реагировали (1,04 _{+ / -0.02} -кратное изменение).

Взятые вместе, эти результаты подтверждают важную роль TCL1 в поддержании клеток-предшественников KC и его потребность в качестве фактора пролиферации, особенно при действии через путь IGF1.

. Наш анализ GO показал, что модуляция экспрессии Tcl1a имеет последствия для дифференцировки KCs.Следовательно, мы исследовали паттерн экспрессии маркеров дифференцировки, которые идентифицируют верхние эпидермальные слои (остистые и гранулярные) (рис. 3A – 3C). Цитокератин 6 (KRT6) считается маркером активации KC [31, 32] и является одним из наиболее дифференциально экспрессируемых генов в нашем GEP-анализе (таблицы S3 – S6). Соответственно, иммунофлуоресценция KRT6 в образцах кожи через 3 дня после депиляции (3dpd) показывает локализованную экспрессию в эпидермисе, окружающем волосяные фолликулы у мышей WT, в то время как только несколько разбросанных клеток экспрессируют KRT6 у мышей Tcl1 – / -.Интересно, что мыши K14-TCL1 демонстрируют сильную и диффузную иммунореактивность KRT6 во всем эпидермисе (рис. 3A). WB-анализ образцов эпидермального слоя 3dpd подтвердил, что экспрессия KRT6 резко снижается у мышей Tcl1 – / – и сильно сверхэкспрессируется в K14-TCL1 по сравнению с мышами WT (изменение в 0,36 и 8 раз, соответственно, фиг. 3C). Цитокератин 10 (KRT10) является одним из первых маркеров дифференцировки, который экспрессируется постмитотическими клетками в остистом слое, и он играет роль в контроле пролиферации [33].Иммунофлуоресценция подтвердила надбазальную экспрессию KRT10 во всех трех генотипах (рис. 3В). В этом случае анализ WB показал, что у мышей Tcl1 – / – и K14-TCL1 наблюдается более чем 2-кратное изменение экспрессии KRT10 по сравнению с мышами WT (2,8 и 2,2 раза, соответственно) (рис. 3C). FLG и IVL являются маркерами терминальной дифференцировки гранулярного слоя, но регулируются противоположным образом в моделях мышей Tcl1a. Эксперименты WB показали, что FLG более экспрессируется у мышей K14-TCL1 (в 3 раза) и меньше у мышей Tcl1 – / – (0.В 4 раза) по сравнению с WT; Напротив, ИВЛ увеличивается в Tcl1 – / – KCs (в 4 раза), тогда как она почти не обнаруживается у K14-TCL1 (в 0,12 раза) (Рис. 3C). В целом, эти данные демонстрируют, что TCL1 глубоко вовлечен в регуляцию как ранних, так и конечных программ дифференцировки KC.

Иммунофлуоресценция для маркера активации KRT6 (зеленый) (A) или маркера дифференцировки KRT10 (зеленый) (B) на эпидермисе мышей WT, Tcl1 – / – и K14-TCL1.Ядерный контраст – йодид пропидия (красный). Увеличение: 40X. Изображения получали конфокальным лазерным сканированием. Показаны репрезентативные изображения трех экспериментов. (C) Вестерн-блот-анализ белковых экстрактов эпидермального слоя мышей WT, K14-TCL1 (K14) и Tcl1 – / – (- / -) на маркеры дифференцировки. Результаты рассчитывали как кратное изменение значений K14-TCL1 или Tcl1 – / – по отношению к значениям OD WT. Образцы также анализировали на маркеры апоптоза PARP1 и CASP3 (D). C-PARP1 и C-CASP3 представляют собой расщепленные формы.Результаты рассчитывали как процентное соотношение расщепленной формы к сумме расщепленных и полных нормализованных значений OD.

Наконец, мы ранее наблюдали, что базальные KCs в эпидермисе Tcl1 – / – мышей аберрантно коэкспрессируют маркеры пролиферации и апоптоза in vivo [1]. Более того, существуют доказательства антиапоптотического эффекта TCL1 за счет уменьшения расщепления PARP1 у людей [25]. В соответствии с этой функцией, в экспериментах WB на эпидермисе 3dpd мы обнаружили, что процент расщепления PARP1 у Tcl1 – / – выше, чем у WT (63% и 35% соответственно), тогда как у K14-TCL1 он сопоставим с WT. (38%) (Рис. 3D).Аналогичные результаты были получены при анализе расщепления каспазой 3 (69%, 33% и 37% соответственно). Следовательно, эти эксперименты подтверждают антиапоптотическую роль TCL1 в мышиных KCs.

В отличие от функции TCL1 в иммунной системе [22], когда мы проанализировали активацию AKT в мутантных и трансгенных KC с помощью киназного анализа, мы не обнаружили существенных различия по отношению к WT (панель A на фиг. S1). В соответствии с этим результатом, фосфорилированный AKT (Ser473) не локализуется совместно с TCL1 в фолликулярных кератиноцитах дикого типа, проанализированных с помощью иммунофлуоресценции (панель B на S1 фиг.).Более того, анализ путей не указал на передачу сигналов AKT среди тех, на которые влияет модуляция TCL1. Скорее, наши данные GEP подчеркнули участие MAPKs в ответ на модуляцию Tcl1a. Каскад MAPK играет центральную роль в регуляции дифференцировки и запрограммированной гибели клеток в эпидермисе посредством фосфорилирования ERK1 / 2, SAPK / JNK и P38 [34].

Таким образом, мы исследовали с помощью анализа WB скорость фосфорилирования ERK1 / 2, SAPK / JNK и P38 MAPK в KC от мышей Tcl1 – / – и K14-TCL1 по сравнению с образцами WT (рис. 4).Мы обнаружили, что потеря Tcl1a увеличивает скорость фосфорилирования P38 по сравнению с мышами WT и K14-TCL1 в 7,2 и 2,8 раза соответственно (рис. 4A и 4C). Напротив, сверхэкспрессия TCL1A индуцировала 32-кратное увеличение ERK1 / 2 (фиг. 4A-4C) и 2,6-кратное увеличение фосфорилирования SAPK / JNK (фиг. 4B и 4C) по сравнению с WT. Нормализованные значения оптической плотности (OD) фосфорилированной и целой форм приведены в приложении (панели A, B и C на фиг. S2). График на фиг. 4C показывает скорость фосфорилирования для этих белков, рассчитанную как отношение OD фосфорилированной формы ко всей форме.Эти результаты показывают, что в отсутствие Tcl1a маршрут P38 гиперактивируется, оставляя нетронутыми передачу сигналов ERK1 / 2 и SAPK / JNK. С другой стороны, сверхэкспрессия TCL1A в базальных KC частично восстанавливает фосфорилирование P38 до уровней WT и усиливает активацию ERK1 / 2 и SAPK / JNK.

Вестерн-блоттинг фосфорилированных форм P38, ERK1 / 2 (A) и SAPK / JNK MAPK (B) на экстрактах белков из кератиноцитов мышей WT, Tcl1 – / – и K14-TCL1.Тубулин альфа (αTUB) использовали для нормализации белковой нагрузки. (C) Нормализованные значения OD использовались для расчета отношения фосфорилированных форм к целым и отображались как среднее и стандартное отклонение трех независимых экспериментов для WT (темно-серый), Tcl1 – / – (светло-серый) и K14-TCL1 ( черный) KCs.

Транскрипционный комплекс активаторный белок 1 (AP1) представляет собой один из основных эффекторов сигнального каскада MAPK в эпидермисе [34, 35].Поскольку наши данные GEP показывают увеличение мРНК cFos в 8,4 раза у мышей Tcl1 – / – по сравнению с WT (таблица S4), мы исследовали изменения в основных субъединицах AP1 cFOS и cJUN.

Мы проанализировали белок cFOS конфокальным анализом на образцах кожи 3dpd трех генотипов (рис. 5A). Первое свидетельство состоит в том, что согласно данным мРНК, экспрессия cFOS усиливается в Tcl1 – / – по сравнению с WT, также на уровне белка, и лишь частично восстанавливается у мышей K14-TCL1. Интересно, что мы также обнаружили, что в коже WT клеточная локализация cFOS полностью ограничена цитоплазматическим компартментом базального слоя.На панели WT на фиг. 5A зеленая флуоресценция, представляющая окрашивание cFOS, сосредоточена вокруг синей флуоресценции ядер. Напротив, в отсутствие Tcl1a cFOS сильно локализован в ядерном компартменте клетки, что визуализируется как голубая флуоресценция на фиг. 5A. В панели K14-TCL1 картина окрашивания cFOS занимает промежуточное положение между образцами WT и Tcl1 – / -. Эти данные предполагают, что TCL1-опосредованное ингибирование транскрипционной активности cFOS, происходящее в человеческом B-CLL [25], может также функционировать в мышиных KCs.Когда мы проанализировали экспрессию cJUN в коже трех моделей мышей, мы наблюдали сопоставимые уровни общего белка cJUN, который был ограничен цитоплазмой базальных KC во всех образцах (рис. 5B). Напротив, фосфорилирование cJUN было связано с ядерной локализацией, и было обнаружено, что количество положительных клеток снижается в Tcl1 – / – и увеличивается в KCs K14-TCL1 по сравнению с аналогом WT. Чтобы подтвердить и количественно оценить эту разницу, мы проанализировали скорость фосфорилирования cJUN с помощью WB и нашли 0.Снижение фосфорилирования cJUN в Tcl1 – / – KCs в 7 раз по сравнению с WT (фиг. 5C и 5D). В то же время сверхэкспрессия TCL1A приводит к увеличению скорости фосфорилирования cJUN в 1,9 и 1,3 раза по сравнению с Tcl1 – / – и WT, соответственно. Нормализованные значения OD фосфорилированной и полной форм приведены в приложении (панель D на фиг. S2). Эти эксперименты показывают, что TCL1 принимает участие в регуляции AP1, контролируя как локализацию cFOS, так и фосфорилирование cJUN.

(A) Иммунофлуоресценция cFOS (зеленый) или (B) cJUN (красный) и фосфо-cJUN (зеленый) на эпидермисе мышей WT, Tcl1 – / – и K14-TCL1. Ядерный контраст – йодид пропидия (синий). Слияние зеленой и синей флуоресценции представляет собой ядерную локализацию (голубой). Увеличение: 40X. Изображения получали конфокальным лазерным сканированием. (C) Вестерн-блоттинг cJUN и фосфо-cJUN на белковых экстрактах KC от мышей WT, Tcl1 – / – и K14-TCL1.(D) Нормализованные значения OD использовались для расчета отношения фосфорилированной формы ко всей форме и графически отображены как среднее и стандартное отклонение трех независимых экспериментов для WT (темно-серый), Tcl1 – / – (светло-серый) и K14-TCL1 ( черные) мыши.

Ранее мы показали, что у взрослых мышей Tcl1 – / – развиваются дефекты кожи из-за резкого снижения маркера стволовых клеток CD34 и пролиферирующих ТА-клеток в волосяном фолликуле, а также из-за дисрегуляции программы пролиферации / дифференцировки / апоптоза в межфолликулярном эпидермисе [1] .В этой работе мы наконец продемонстрировали, что Tcl1a необходим для правильного программирования и активации эпидермальных KC.

Анализ GEP показывает, что потеря Tcl1a вызывает глубокое нарушение регуляции экспрессии генов в эпидермальной ткани. Кроме того, модель мыши, несущая управляемый K14 ген TCL1A на нулевом фоне Tcl1a, больше похожа на WT, чем на Tcl1 – / -, поэтому дает первое общее статистическое подтверждение ранее наблюдаемой способности трансгенного K14-TCL1 мыши, чтобы спасти мутантный фенотип Tcl1 – / -.В частности, экспрессия 55% генов с нарушенной регуляцией в Tcl1 – / – восстанавливается в KCs K14-TCL1. Среди них 36 генов (39%) полностью спасены на физиологическом уровне или отменены, что указывает на тесную связь с TCL1. Интересно, что 29 из этих 36 генов подавлялись в Tcl1 – / – KCs, подтверждая роль TCL1 как активатора транскрипции [25] также в эпидермальных клетках. С другой стороны, мышь K14-TCL1 не способна спасти все гены, на которые влияет отсутствие Tcl1a, особенно те, которые сверхэкспрессируются, указывая тем самым, что присутствие Tcl1a необходимо, но недостаточно для этих факторов.Другая возможность состоит в том, что TCL1A, управляемый K14, неспособен регулировать факторы, действующие в надбазальных слоях, из-за того, что его экспрессия ограничена базальным слоем.

На функциональном уровне анализ GO указал на дифференцировку и деление клеток как на две функции, дефектные в Tcl1 – / – KCs, которые восстанавливаются в K14-TCL1. В отличие от T- и B-клеточных трансгенных моделей TCL1A, сверхэкспрессия в эпидермальных KCs не вызывала гиперпролиферации, и мы не наблюдали образование опухолей кожи у мышей K14-TCL1 [1].Этот фенотип согласуется с нашими данными GEP и анализом GO и может быть связан с более мягкой активностью промотора K14 по сравнению с lck или Eμ. Альтернативно, программы пролиферации / выживания в KC могут подвергаться жесткому контролю, способному преодолеть сверхэкспрессию TCL1A. Скорее, чрезмерно представленные гены относятся к ответу на стимул и условиям клеточной подвижности GO без каких-либо доказательств какого-либо аберрантного фенотипа.

Krt6 – один из наиболее значимых дифференциально экспрессируемых генов, обнаруженных с помощью нашего анализа GEP.Krt6 конститутивно не экспрессируется в коже, но быстро индуцируется после повреждения эпидермиса (например, восковой депиляции) и считается маркером активации KCs как для пролиферации, так и для дифференцировки [31, 32]. Интересно, что мы наблюдали, что в эпидермисе 3dpd WT белок KRT6 в основном экспрессируется базальными клетками и сохраняется в некоторых надбазальных клетках; в Tcl1 – / – эпидермисе экспрессия KRT6 резко снижена, а в K14-TCL1 KRT6 высоко экспрессируется во всех слоях. Таким образом, экспрессия KRT6 сильно зависит от регуляции TCL1, индуцируется в базальном слое и поддерживается в надбазальных слоях, указывая тем самым, что KRT6 может быть хорошим кандидатом, по крайней мере частично, для наблюдаемых дифференцированных и / или пролиферативных фенотипов.Напротив, надбазальный маркер KRT10 повышен у Tcl1 – / -, а также у мышей K14-TCL1 по сравнению с WT, что позволяет проиллюстрировать вышеупомянутые сверхэкспрессируемые «несохраненные» гены. Тем не менее, экспрессия маркеров терминальной дифференцировки FLG и IVL изменяется в Tcl1 – / -, но сохраняется у мышей K14-TCL1, указывая тем самым, что в надбазальных KCs некоторые программы дифференцировки могут быть активированы из базального слоя. Передача сигналов апоптоза представляет собой еще один интересный пример базальной / надбазальной стратификации, на которую влияет потеря Tcl1a.В нашей предыдущей работе мы наблюдали пролиферативный маркер, сосуществующий с апоптотическими событиями в базальном слое Tcl1 – / – мышей, хотя запрограммированная гибель клеток обычно активируется только в терминально дифференцированном слое. Эта аберрация была устранена за счет управляемой K14 сверхэкспрессии TCL1A [1]. Здесь мы показали, что апоптотические факторы PARP1 и CASP3 аномально активируются в Tcl1 – / – KC по отношению к WT, и экспрессия K14-TCL1 достаточна для восстановления физиологических уровней активации, напоминая антиапоптотический эффект TCL1, наблюдаемый при ХЛЛ человека [ 25].

Пролиферация – еще одна дефектная функция, которую мы описали в Tcl1 – / – скине [1], на что также было указано в этой работе анализом GO. Соответственно, первичные KC от мышей Tcl1 – / – почти неспособны образовывать колонии или пролиферировать при помещении в полную среду. С другой стороны, этот фенотип полностью устраняется, когда TCL1A повторно вставляется в базальные клетки мыши K14-TCL1, имитируя поведение WT. Эти эксперименты подтвердили, что сверхэкспрессия TCL1A не вызывает гиперпролиферации KC.Анализ путей идентифицировал фактор роста и MAPK как одни из наиболее значимых путей, измененных в Tcl1 – / – KCs. Поскольку известно, что IGF1 регулирует эпидермальную пролиферацию, подвижность и поведение клеток-предшественников, действуя через пути MAPK-AP1 и / или PI3K-AKT [29, 30, 36, 37], мы сосредоточились на IGF1-индуцированной пролиферации. Интересно, что мы обнаружили образец пролиферации, очень похожий на тот, который был получен при стимуляции сывороткой, с нарушенной пролиферацией Tcl1 – / – KCs, которая в значительной степени компенсировалась экспрессией K14-TCL1.Это открытие демонстрирует, что ген Tcl1a определенно необходим для пролиферации KCs как путем индукции сыворотки, так и IGF1.

На самом деле, несмотря на то, что наиболее известной функцией TCL1 является усиление активности киназы AKT [21, 23], мы не обнаружили каких-либо различий в активности киназы AKT между тремя моделями мышей. Это открытие согласуется с моделью двухклеточного эмбриона, которая не показала различий между содержанием фосфорилированного AKT у Tcl1 – / – и мышей WT [20]. Noguchi et al. предположили, что активность киназы AKT, поддерживаемая у Tcl1a нулевых мышей, может быть частично связана с присутствием пяти белков семейства TCL1B и MTCP1 в геноме мыши [38].Соответственно, мы сообщили о высоком уровне экспрессии изоформы Tcl1B2 в эпидермисе мышей, особенно в Tcl1 – / – one [1].

Что касается IGF1, большинство входящих сигналов, которые регулируют пролиферацию, дифференцировку и апоптоз в межфолликулярном эпидермисе, проходят через три основных каскада MAPK: ERK1 / 2, SAPK / JNK и P38 с несколькими взаимосвязями между каскадами [39]. Активация ERK1 / 2 в первую очередь опосредует сигналы пролиферации и выживания от ряда различных поверхностных молекул, включая факторы роста и белки клеточной адгезии; с другой стороны, P38 MAPK-зависимые механизмы в основном участвуют в регуляции процессов дифференцировки и апоптоза [34, 40–43].SAPK / JNK способен регулировать пролиферацию, дифференцировку, выживание и / или миграцию, таким образом настраивая различные процессы, такие как гомеостаз тканей, клеточный метаболизм, воспаление и канцерогенез [44]. Относительные активности MAPKs можно оценить по скорости их фосфорилирования, и здесь мы приводим доказательства того, что Tcl1 – / – мыши обнаруживает гиперактивацию P38 MAPK, которая может быть ответственна за наблюдаемый апоптотический фенотип. Кроме того, гиперфосфорилирование P38 может объяснять дифференциальные расстройства, такие как сверхэкспрессия IVL [45].Напротив, сверхэкспрессия TCL1A с помощью трансгена, управляемого K14, увеличивает фосфорилирование ERK1 / 2 и SAPK / JNK. То, что TCL1 может влиять на фосфорилирование ERK1 / 2, наблюдалось также в B-CLL, где нацеленная на TCL1 микроРНК-181b также снижала фосфо-ERK1 / 2 [46]. Таким образом, TCL1 может действовать как фактор пролиферации / выживания и регулятор дифференцировки, увеличивая фосфорилирование ERK1 / 2 и SAPK / JNK и поддерживая низкие уровни фосфо-P38.

В эпидермальных KCs нижестоящие мишени передачи сигналов MAPK в основном представлены фактором транскрипции AP1, который состоит из гомо- или гетеродимеров, в основном принадлежащих к семействам белков FOS и JUN.MAPK могут влиять на активность AP1 как путем прямого фосфорилирования, так и путем активации транскрипции промоторов конкретных компонентов AP1. Множественные члены семейства AP1 экспрессируются в эпидермисе и образуют разные пары димеров, регулируя экспрессию нескольких генов-мишеней и контролируя функции KC [45, 47, 48]. Не случайно с помощью чип-анализа мы обнаружили среди наиболее дисрегулируемых генов несколько факторов, участвующих в передаче сигналов MAPK, и, в частности, эффекторный cFos AP1.Тем не менее, TCL1, как сообщается, напрямую связывает cFOS, таким образом ингибируя апоптоз [25, 49]. Наши данные согласуются с этим наблюдением, и мы можем предположить, что TCL1 предотвращает транскрипционную функцию cFOS, секвестируя этот фактор в цитоплазму, имея cFOS в основном ядерную локализацию в Tcl1 – / – эпидермальных KCs. Этот фенотип устранен, хотя и не полностью, у мышей K14-TCL1. Более того, мы показали, что фосфорилирование cJUN снижается в отсутствие Tcl1a и увеличивается, когда TCL1A повторно вводится в KC.Следовательно, у мышиных KCs TCL1, по-видимому, оказывает стимулирующее, а не ингибирующее действие на активность cJUN, что было замечено в B-CLL Pekarsky et al. [25]. Это согласуется с ролью cJUN в пролиферации, дифференцировке и заживлении ран в эпидермальных клетках мышей [50-52].