Правило 11 в колористике окрашивания: Правило 11 в колористике окрашивания волос

Содержание

Правило 11 в колористике окрашивания волос


Как правильно использовать корректоры для волос

Микстон или корректор цвета для волос – это концентрат цвета в чистом виде, который есть в любой профессиональной палитре красителей для волос.

Основная задача цветов-корректоров — усиление яркости оттенков или же, наоборот, устранение нежелательного тона.

Не обойтись без корректоров и в том случае, если стоит задача в создании нового креативного оттенка. Микстоны используют не сами по себе, а только в сочетании с тем или иным оттенком.

Чистый концентрат цвета — нейтрализовать или добавить яркости

Мастера парикмахеры работают с корректорами по такому же принципу, как и с основными цветами в палитре. При этом для определения необходимого цвета микстона используют цветовой круг.

Цветовой круг с первичными, вторичными и третичными цветами

Микстона относятся к хроматическим цветам, которые делятся не первичные, вторичные, третичные и далее по списку. Наиболее часто в микстонах используются две первые группы.

  • Первичные цвета — являются самостоятельными, их не получить путем смешивания, парикмахерском спектре это — желтый, красный и синий.
  • Вторичные цвета — получаются при смешивания двух первичных. Например, синий с желтым дают зеленый.

Нейтрализация нежелательных тонов

Основная суть нейтрализации оттенка — необходимо взять цвет, расположенный в цветовом круге напротив оттенка требующего устранения — это позволит получить при смешивании нейтральный цвет.

Задача мастера правильно рассчитать пропорции и цвет корректора для применения взаимопоглощения.

  • Например: для устранения зеленого цвета в краситель необходимо добавить красный микстон.
  • Если необходимо убрать желтизну, возникающую после обесцвечивания, в краску добавляют фиолетовый корректор. Он в круге расположен напротив желтого.

Для решения такого рода задач микстон добавляют в краситель в небольшом количестве, и чем волос более светлый, тем меньше должно быть корректора.

Это связано с тем, что такие волосы отличаются пористой структурой, и очень часто тон ложится неравномерно. Особо заметно это на кончиках и в области висков. И если перестараться с корректором цвета, может появиться темный оттенок.

Для расчета добавляемого количества микстонов используют правило «Десяти» или «Одиннадцати».

  • По правилу Десяти: желаемый оттенок цвета вычитаем из десяти, в формуле это выглядит так: 10-6(для примера)=4см это и есть необходимое количество грамм корректора. То есть на шестьдесят грамм краски берем 56 грамм краски нужного оттенка + 4 грамма(8см) корректора и добавляем 60 грамм окислителя (при смешивании 1:1).
  • В правиле Одиннадцати формула будет похожа: 11-6(наш пример)=5см. Пять сантиметров равны 2,5 граммам корректора цвета. На выходе получаем расчет: 55 грамм оттенка краски + 5 грамм микстона + 60 грамм окислителя.

Таблица расчета: правила работы с корректором цвета

Сколько добавлять корректора

Придание цвету яркости

Когда стоит задача сделать оттенок ярче и насыщеннее, количество микстонов в краске не может превышать 1/4 от всей смеси.

Как смешивать: на 60 грамм краски смешиваем 45 грамм необходимого оттенка + 15 грамм корректора требуемого цвета + 60 грамм окислителя

Однако не всегда микстоны дают только ярость, иногда требуется немного разбавить оттенок — в этом случае поможет бесцветный корректор. Бесцветные микстоны могут быть:

  • Аммиачные — осветляющие крема, позволяющие менять глубину тона, при этом усиливают осветляющую способность красителя. Используется, как самостоятельно (1 к 1 с окислителем 3% или 6% с выдержкой на волосах не больше 30-40 минут), так и в смеси с красителями в пропорции 1 к 3.
  • Безаммиачные — уменьшают насыщенность подтонов, в связи с чем позволяют добиваться пастельных оттенков в окрашивании. Используются в смеси с красителями в малом количестве.

Палитра корректоров – какие цвета и как используются

  • Желтый – помогает убрать фиолетовый цвет, сочетается с медными, красными тонами, делает их теплее.
  • Оранжевый – придает насыщенности теплым, медным оттенкам.
  • Красный – делает ярче красные тона, применяется для нейтрализации зеленого.
  • Фиолетовый – придает интенсивности фиолетовым тонам, нейтрализует золотые и желтые цвета.
  • Синий – устраняет оранжевый.
  • Зеленый – убирает красноту.
  • Пепельный – придает матовости пепельным тонам, убирает медные и оранжевые оттенки.
  • Джокер – позволяет любой цвет сделать светлее. Удобен при работе со светлыми волосами.

При правильном использовании краски и корректора для волос можно получить отличные результаты.

Как пользоваться корректором Эстель

Корректоры от фирмы Эстель – это удобный инструмент для создания нестандартных оттенков. Если клиент просит тот или иной тон, получить его в точности помогут именно профессиональные корректоры.

Компания Эстель предлагает довольно популярную среди парикмахеров и стилистов линию ESSEX Correct. Ценят ее и за богатую цветовую палитру, и за доступную стоимостью. В серии есть как цветные, так и бесцветные микстоны.

  • 1.0/00А – бесцветный крем с аммиаком – необходим для осветления. Его смешивают с оксигеном ESSEX 3%, 6%, 9% в пропорции 1 к 1. Количество микстона высчитывается следующим образом: /Х (Х/ХХ) (30 г) + 0/00А (1-10 г) + оксигент ESSEX.
  • 2.0/00N –бесцветный нейтральный крем. Его используют для создания промежуточных тонов.
  • 3.0.77, 0/66, 0/55, 0/44, 0/33, 0/22, 0/11 –цветные корректоры. Помогают повысить интенсивность оттенка или же убрать нежелательные тона. Имеют консистенцию крема, легко наносятся. В составе присутствует аммиак. Смесь в пропорции 1 к 1 наносят на чистые сухие волосы и оставляют на 35 минут. Можно использовать для нагрева инфракрасные лучи.
Рекомендации по количеству микстонов:

1 г = 2 см.

  • На 30 г крем-краски ESSEX: 10/X – 2 см, 9/X – 3 см, 8/X – 4 см, 7/X – 5 см, 6/X – 6 см, 5/X – 7 см, 4/X – 8 см, 3/X – 9 см, 1/X – 10 см.
  • На 30 г крем-краски S-OS – 1 см.

Рекомендуемая формула расчета количества микстона: Х/Х (Х/ХХ) (30 г) + 0/ХХ (1-10 г) + оксигент ESSEX.

Если необходимо использовать средство как краситель, нужный оттенок перемешивают с оксигентом ESSEX 3% в пропорции 1 к 1. Также допускается смешивание с активатором ESSEX 1,5% в пропорции 1:2.

Работа с корректорами требует внимательности и осторожности, иначе можно получить совсем не тот результат, который был запланирован.

korrekto.ru

Корректор цвета или микстона

В бренде Periche Personal микстона используются для коррекции нежелательного оттенка, для рассветления красителя по глубине тона, для усиления пепельного оттенка . Корректоры 0.22 и 0.12 содержат концентрированные пигменты синего и фиолетового цвета. Требуемое количество микстона зависит от уровня тона. Чем светлее тон, тем меньше количество микстона требуется добавлять. Для того чтобы количество корректора было достаточным, пользуйтесь правилом 11 (одиннадцати).

1) Правило 11 (правило добавления корректора цвета в краситель)

11-7=4

11- неизменяемое число

7-желаемая глубина тона клиента (изменяется от желания клиента)

4-см. корректора цвета на 30гр. красителя (окислительная эмульсия не рассчитывается) на корректор.

В специальный блондин корректор цвета добавляют до 2-3 см. на 30гр. красителя.

Нейтральный корректор 0.

Нейтральный корректор это крем содержащий аммиак.

а)Мелирование или осветление натуральных волос.

Натуральный корректор 1 часть + окислительной эмульсии 1 часть

Время выдержки 35 минут.

Используется для получения эффекта слабого осветления или мелирования (эффект выгоревших прядей)

б)Расветление красителя

Для получения более светлых оттенков 20гр. 9.3 + 20гр. нейтрального корректора

Результат- 40гр 10.3

Cyber Color Milk Shake

Окрашивающая маска с полуперманентным эффектом, непревзойденная яркость, 10 фантазийных оттенков (красный, фиолетовый, синий, зеленый, золотистый, пепельный, оранжевый, желтый, розовый, коричневый) . Применяется для получения очень ярких оттенков на осветленных волосах, после окрашивания для поддержания цвета, для усиления пигмента в красителе. Personal Cyber color ухаживает за волосами в момент окрашивания, так как его активные вещества питают и увлажняют волосы в течении всего времени выдержки. Очищенные красители с интенсивными и концентрированными пигментами обеспечивают блеск и насыщение цветом.

Способ применения: нанести кисточкой на сухие или влажные волосы в чистом виде или смешать с любой маской Periche для получения прозрачных пастельных тонов. Выдержать 15-20 мин. Смыть.

Смывается через 8-12 раз.

Гель-корректор «Ледяной блондин»

Специальное средство для устранения желтого цвета после осветления или нежелательных оттенков блондированных волос без необходимости окрашивания. Наличие комплекса из четырех растительных экстрактов обогащает формулу благодаря своим успокаивающим, смягчающим и защитным свойствам. Масло ромашки, экстракт липы, лаванды и гамамелиса вирджинского.

Способ применения: Смешать КОРРЕКТОР 01 с КОРРЕКТОРОМ 02 в миске. Нанести смесь на влажные или сухие волосы. Выдержать 7-25 мин. Смыть.

Удаление цвета

Если клиент желает перейти от очень темного тона к более светлому,

необходимо применить данную технику, так как осветлить уже окрашенные

волосы при помощи одной лишь краски невозможно (основное правило: краска краску не удаляет).

Как удалять цвет.

Пропорция смешивания и время выдерживания рассчитаны с учетом

интенсивности осветления и результатами технической диагностики

(изначальный цвет волос, желаемый цвет волос, пористость волос).

Осветление до 3-4 тонов

Приготовление:

20 гр. осветляющего порошка + 60 гр.

окисляющей эмульсии 6% (20 vol).

Время выдерживания от 20 до 30 минут.

Осветляющий порошок White Color

Обесцвечивающий порошок White Color, содержит только высококачественные компоненты и обеспечивает превосходное осветление, сохраняя структуру волос. Это

универсальный продукт, который подходит для любой техники: мелирования,

создания бликов и особых эффектов осветления. Сине-фиолетовый пигмент, нейтрализует желтовато-оранжевые тона. При смешивании с окисляющей эмульсией White Color образует мягкий крем, который легко наносится и гарантирует

фантастические результаты осветления.

Метод применения и приблизительное время выдерживания:

смешайте 30 г обесцвечивающего порошка White Color с кремовой окисляющей

эмульсией в неметаллической емкости в следующих пропорциях:

Осветление на 4-5 тонов = 30 гр. осветляющего порошка + 60 г

ок.эмульсии 3; 6 %. (время воздействия 20-50 минут).

Осветление на 5-6 тонов =30 гр. осветляющего порошка + 45 г

ок.эмульсии 3; 6%. (время воздействия 20 -50 минут).

30

Осветление на 6-7 тонов =30 гр. осветляющего порошка + 30 г

ок.эмульсии 3; 6%. (время воздействия 20-50минут).

Для более деликатного осветления выбирайте более слабую окисляющую

эмульсию и разводите в соотношении 1:2. Постоянно проверяйте состояние

волос во время процедуры осветления.

Осветляющий порошок iWhite Color

без аммиака

Осветляющий порошок без аммиака. Подходит для всех техник осветления, применяемых профессионалом. Продукт по обесцвечиванию создан по новой технологии – без аммиака, что позволяет бережно относится к структуре волос. Достичь максимального осветления возможно, учитывая плотность волоса и соблюдая рекомендации по применению.

Порошок без запаха, не пылит и не наносит вреда дыхательным путям. ПРИМЕНЕНИЕ: смешать обесцвечивающий порошк в неметаллической емкости в пропорциях от 1:1 до 1:2 с окислителем эмульсионным 1,5%; 3%; 6%; 9% или 12% в зависимости от применяемой техники обесцвечивания. Перемешать до однородной массы и нанести на волосы.

Время воздействия на волосах 10-50 минут в зависимости от желаемой степени обесцвечивания.

Корректор цвета Out Colors

Коррекция цвета – это техническая операция, предназначенная для деликатного удаления искусственного пигмента с волос

Выполняется с помощью КОРРЕКТОРА ЦВЕТА от Periche Profesional

Состав из фруктовых кислот на мягкой основе с ухаживающими и смягчающими компонентами, позволяет удалить неоднородность и плотность цвета, решить проблему пятен в результате некорректного окрашивания

Декапирует на 2-3 тона, при полном сохранении естественного пигмента

Идеален для удаления ярких оттенков медных, красных, фиолетовых

Не содержит аммиак и перекись водорода

Способ применения:

составы «1» и «2» строго на весах.

  • Нанести на окрашенную часть волос кисточкой, накрыть шапочкой

  • Время воздействия 10 мин с дополнительным теплом или 15-20 мин без тепла

  • Тщательно смыть состав с волос 2-3 раза шампунем pH 5.5

  • Подсушить волосы полотенцем

  • Нанести на одну прядь 3% окислительную эмульсию на 5-7 мин., чтобы проверить, насколько хорошо удалены искусственные пигменты из волос.

  • Смыть с волос 3% окислительную эмульсию, подсушить волосы

  • Если после нанесения 3% окислительной эмульсии цвет проявился снова, по длине или на концах, повторить нанесение смеси КОРРЕКТОРА ЦВЕТА «1» и «2» на наиболее темные участки волос

  • Далее действовать по предложенной выше схеме

  • Если Вас и клиента устраивает цвет на пряди после обработки ее 3% окислительной эмульсией, можно приступать к окрашиванию

  • В прикорневой зоне работайте как обычно, по правилам окрашивания

  • Выбранный цвет красителя по длине должен быть светлее на 2 тона, чем цвет на обработанной пряди, или вместо красителя можно использовать корректор 0

  • Смешивать краситель или корректор 0 нужно с 9% окислительной эмульсией в обычной пропорции 1: 1,5

  • Время воздействия в прикорневой зоне будет обычное

  • Время воздействия по длине 10-20 мин

Пример:

Натуральный цвет волос клиента в прикоревой зоне 7/0

Цвет по длине 5/4

Желаемый цвет 7/44

1) При помощи КОРРЕКТОРА ЦВЕТА удалить пигмент с длины волос

2) Прикорневую зону окрасить цветом 7/44 + 3% в пропорции 1:1,5

3) Длину окрасить цветом 9/44 + 9% или 0/0 + 9%

Общее время воздействия: 30 минут

КОРРЕКТОР ЦВЕТА способен удалить искусственный пигмент не более, чем на 2 тона светлее

После работы с КОРРЕКТОРОМ ЦВЕТА волосы необходимо окрашивать или полностью обрабатывать 3% окислительной эмульсией, для завершения реакции окисления в волосах.

studfiles.net

Как составлять и решать колористические задачи.

Все парикмахеры колористы разговаривают на своем языке.  Колористические задачи, это стандарты которые отличают колориста высокого уровня от любителя.

Когда вы придете устраиваться в элитный салон красоты вас попросят решить колористическую задачу. Они не будут смотреть ваши дипломы, и не захотят знать сколько лет вы в профессии. С вас потребуют прямое доказательство того, что вы специалист высокого уровня.

Проверьте себя. Представьте, что вы пришли устраиваться на работу и перед вами поставили простую задачу.

Натуральная база: 6.0

70% седины.

Волос пористый, поврежденный. Цвет по длине и на концах: 9.3

Желаемый результат: 8/06

У вас есть 15 минут на то, чтобы решить эту задачу. Время пошло.

Напишите свой вариант решения в комментариях.

Как оформлять и решать колористические задачи?

Колористика – точная наука. Она не терпит догадок. Ошибка в одну цифру может навсегда запятнать вашу репутацию.

Для того, чтобы точно просчитать цвет, у вас всегда под рукой  должна быть колористическая карта.

Она необходима вам для того, чтобы точно определить уровень глубины тона натуральных или окрашенных волос. Определить желаемый цвет. Это условия колористической задачи. Колористические карты разных красителей вы найдете в конце данной статьи.

Как  определить цвет волос по фотографии онлайн читайте на этой странице>>>.

Цветовые обозначения.

Цвет волос обозначается при помощи двух характеристик – уровня глубины тона и направления цвета.

Уровень глубины тона (УГТ) – это градация натурального цвета волос по светлоте.  На практике придумали классифицировать все оттенки волос от 1 до 10 – шкала уровней глубины тона.

Уровень глубины тона.

Номеру 1 – соответствует самый темный, черный цвет волос.

10 – самый светлый.

Такую шкалу натуральных оттенков волос вы можете встретить в парикмахерской палитре. В основном обозначения общепринятые, но могут незначительно отличаться. Некоторые расширяют ее до 12 ступеней, пропуская некоторые уровни. Так же различия вы можете наблюдать в названиях базовых оттенков. Одни используют понятие шатен вместо коричневого, другие – русый заменяют блондином и наоборот. Это связано с языковой традицией стран производителей косметики и особенностями перевода названий на русский язык.

Направление цвета – это  оттенок, который в итоге проявляется в волосах. Направление цвета так же обозначается в цифрах. Направление цвета указывают цифры после дроби или запятой. Например 6.43 или 6,34.

Каждой цифре присвоен определенный цвет. 6 это уровень глубины тона, 43 – это направление цвета. Когда клиент говорит нам, что хочет волосы медного оттенка, она, сама того не понимая, обозначает именно направление цвета.

Палитра, практически, любой краски для волос включает в себя золотистые, медные, пепельные, красные, фиолетовые оттенки.

СИСТЕМА КОДИРОВАНИЯ ЦВЕТА.

Направление цвета принято обозначать цифрами или буквами, через запятую, тире, или дробь после номера уровня глубины тона. Когда направление цвета указывается буквами, разделительные знаки не ставятся, например P01.

Шкала направления цвета, у разных производителей косметики редко совпадает. Так цифра 2 в одних красителях обозначает фиолетовое направление, в других матовые оттенки, зеленую основу. Цифра 5 обозначает красное направление, у других, красный идет под номером -6.

ОБЩИЕ ПРАВИЛА КОДИРОВАНИЯ ЦВЕТА.

  1. Первая цифра в номере красителя означает уровень глубины тона, вторая-направление цвета.
  2.  Нейтральное или натуральное направление чаще всего обозначают цифрой 0 или буквой N.  Они указывают на чистоту оттенка и отсутствие дополнительных цветовых нюансов.
  3.  Если в номере красителя после разделительного знака следуют две или три  цифры или буквы, то первая из них обозначает доминирующий оттенок или основной цветовой нюанс, а  вторая и третья – дополнительные цветовые нюансы. 6.43 или 6/43
  4. Порядковый номер оттенка определяет его количество. Чем ближе к разделительному знаку он находиться, тем больше его количества и наоборот. Например 6.31, 3-золотистый, 1-пепельный. Это значит, что в этом оттенке золотистого больше чем пепельного.
  5.  Повторяющиеся одинаковые цифры или буквы в направлении цвета указывают на интенсивность оттенка. 5/55 или 0/400
  6. Итак, благодаря системе кодирования, мы можем присвоить любой номер любому оттенку и наоборот расшифровать его.
Окислители.

Окислитель это стабилизированный раствор перекиси водорода который добавляют в краситель. От процента окислителя зависит результат окрашивания.

1.5% или 1.9% ,1.7%  окислители  предназначены  для тонирования волос. Они работают с без аммиачными красителями. Их еще называют полу перманентные или тонирующие.

3% окислитель окрашивает волос тон в тон.

6%  окислитель окрашивает волос на 2 уровня глубины тона светлее.

9% окислитель окрашивает на 3 уровня глубины тона светлее.

12% окислитель окрашивает на 4 уровня глубины тона светлее. Применяются в работе со специальными  блондами , осветляющими сериями красителей.

К вам пришла клиентка с цветом волос на 6 уровне. Смотрим по таблице уровней тона – это темный блондин.

Она говорит вам чтобы вы сделали ее волосы светлее.

Вы показываете палитру оттенков и она выбирает 8 уровень глубины тона.

Вы смотрите, что 8 уровень светлее чем 6 на два тона.

Берете краситель 8.3 и вам нужно добавить к нему окислитель.

Какой окислитель выбрать?

Тот который поднимает на два уровня глубины тона выше.

6% окислитель окрашивает волос на 2 уровня глубины тона светлее.

Вы берете оттенок 8.3+6% окислитель и в результате, место темной блондинки ваша клиентка становится светлой блондинкой.

Задача выглядит так.

Натуральный уровень: 6.0

Желаемый результат: 8.3

Рецептура (решение):

8.3+6%

Это пример простой задачи. Решение усложняется если в результате нужно получить холодный оттенок 8.1. В этом случае вам необходимо нейтрализовать фон осветления.

Что такое фон осветления и как его нейтрализовать вы можете посмотреть в бесплатных видео:

WELLA
Koleston Perfect (Аммиачный, стойкий краситель) Koleston Perfect (Аммиачный, стойкий краситель) Koleston Perfect (Аммиачный, стойкий краситель) Color Touch (Тонирующий, полуперманентный краситель) Color Touch (Тонирующий, полуперманентный краситель) Color Touch Plus ( Тонирующий краситель для закрашивания 70% седины. Работает с 4% oxi)
Loreal        
Dialight (Тонирующий, полуперманентный краситель) (Аммиачный, стойкий краситель) Majirel (основная палитра) Majirouge (модные нюансы) Majiblond (супер осветляющая серия) Diariсhesse ( Тонирующий краситель для закрашивания 70% седины. Работает с 4,5 % oxi)
Estel
Estel (Аммиачный стойкий краситель). Estel Sense (Тонирующий, полуперманентный краситель).
LONDA
Londa. Стойкие и тонирующие красители.
IGORA
IGORA. Тонирующие и стойкие оттенки.

uhairstylist.com

Колористика: Азы Теории и Практики для Парикмахеров

Искусство колористики подразумевает окрашивание волос в разные цвета. Для того, чтобы этому научиться, нужны не только специальные знания и навыки, но и умение тонко чувствовать цвета и угадывать, какой оттенок получится в результате смешения тех или иных красок. Осваивать колористику нужно с основ этой «науки», с ними мы и хотели бы вас познакомить.

Что такое колористика?

Колористика – это наука, изучающая принципы гармоничного смешивания цветов и оттенков. В рамках обучения парикмахерскому искусству эта наука помогает правильно подбирать и комбинировать тона при окрашивании – так, чтобы причёска идеально сочеталась с лицом, внешностью и имиджем клиента.

Ещё в древности учёные занимались изучением цвета, и он стал основой для многих научных теорий и открытий. Цветоведение было тесно связано с физикой, химией, искусством, философией и эстетикой. В начале 20 века лауреат Нобелевской премии В. Оствальд провёл систематизацию цветов, представив их на окружности со спектральными сегментами. Данная схема позволила создать цветовой круг – идеальную модель колористической гармонии.

Круг Оствальда представлен основными и промежуточными цветами:

  • Основные цвета – это красный, синий и жёлтый (если их смешать между собой, можно получить все остальные цвета).
  • Вторичные цвета – те, что получаются в результате смешивания двух основных цветов. К примеру, зелёный – это комбинация жёлтого и синего, а оранжевый представляет собой смесь красного и жёлтого.
  • Третичные цвета образуются при смешении основного и вторичного цвета. Например, сиреневый – это синий и фиолетовый, а бирюзовый – это синий и зелёный.

При прочтении цветового круга важно учитывать 2 особенности:

  • Цвета, находящиеся рядом (в вершинах треугольника), хорошо гармонируют друг с другом.
  • Чтобы устранить нежелательный цвет при окраске волос, необходимо выбрать тот оттенок, который расположен на круге напротив ошибочного колера.

Допустим, во время мелирования на локонах появилась нежелательная желтизна и её необходимо нейтрализовать. Сделать это можно с помощью цветового круга. Выбираем цвет напротив жёлтого и наносим его на волосы.

Таким образом, колористический круг – незаменимый инструмент всех парикмахеров, позволяющий грамотно подбирать нужные колеры, составлять из них комбинации и убирать нежелательные тона при окрашивании.

Основные способы окрашивания

Среди многочисленных видов колорирования выделяют 3 основных:

  • Омбре – окраска волос, при которой тёмные корни плавно переходят в светлые кончики.
  • Мелирование – высветление и окрашивание отдельных прядей волос. При мелировании довольно часто возникают ошибки и необходимость удаления нежелательных оттенков при помощи цветового круга.
  • Блондирование – колорирование локонов разными цветами блонда (такой вариант окраски идеален для русых волос).

Цветовые уровни

Цвета волос по темноте разделяют на уровни от 1 до 10:

  • Номер «10» – это самый светлый оттенок, а единица – это чёрный цвет.
  • 2-й и 3-й тона – это коричневые и каштановые цвета локонов (преобладающими пигментами в них являются синий и красный, а жёлтый здесь почти отсутствует).
  • Цвета 4-7 – это оттенки, образованные из красного с небольшой примесью синего и жёлтого (то есть коричнево-русые тона волос).
  • Краски с номерами 8 и 9 – это господство жёлтого (от данного пигмента бывает непросто избавиться, т.к. он залегает глубоко в структуре локонов).

Существуют также тона под номерами «11» и «12», они считаются супер-светлыми красками.

По цифровому коду, указанному на упаковке краски, вы легко можете определить точный тон красителя. Первая цифра в нём говорит об уровне светлости, вторая – показывает ещё один пигмент в краске, а третья – второстепенный тон для придания дополнительного акцента на волосах. К примеру, оттенок «8.13» — это светло-русая бежевая краска, где восьмёркой обозначается светло-русый цвет, единица свидетельствует о пепельном оттенке, а тройка указывает на дополнительный золотистый тон (его в 2 раза меньше, чем пепельного).

Маркировка одной или двумя цифрами говорит об отсутствии в красителе оттенков и о чистоте второстепенного тона.

Чтобы новый цвет волос смотрелся естественно, между ним и вашим цветом должно быть не более двух тонов.

Виды красок для волос

Напоследок поговорим о природных и искусственных красителях… Существует 5 видов красок для волос, каждый из них имеет свои преимущества и недостатки:

  • Осветляющие составы – воздействуют на волосы агрессивно, выжигая основной природный пигмент и обезвоживая локоны. Частое окрашивание шевелюры данным типом красителей нежелательно.
  • Перманентные красители – не меняют природную пигментацию локонов, а лишь слегка воздействуют их структуру путём окисления. Такие краски идеальны для использования на поседевших волосах, а также при желании сменить цвет локонов на 1-5 тонов.
  • Полуперманентные красящие составы – не содержат аммиака и перекиси водорода, поэтому не затрагивают природный пигмент волос. Эти красители не вредят волосам, однако они довольно быстро смываются – за 5-6 моек шампунем.
  • Оттеночные бальзамы и шампуни – служат для того, чтобы усиливать блеск или подчёркивать имеющийся тон волос. Эти средства не оказывают никакого вреда волосам, поэтому ими можно пользоваться долго.
  • Натуральные краски – самые безвредные красители. Окраска волос хной, басмой, кофе не только не вредит волосам, но и укрепляет их структуру. Стоит сказать, что после длительного использования природных красок химические средства могут оказаться неэффективными.

picaschool.ru


Корректор цвета или микстона

0.22; 0.12; 10.12; 0.

В бренде Periche Personal микстона используются для коррекции нежелательного оттенка, для рассветления красителя по глубине тона, для усиления пепельного оттенка . Корректоры 0.22 и 0.12 содержат концентрированные пигменты синего и фиолетового цвета. Требуемое количество микстона зависит от уровня тона. Чем светлее тон, тем меньше количество микстона требуется добавлять. Для того чтобы количество корректора было достаточным, пользуйтесь правилом 11 (одиннадцати).

1) Правило 11 (правило добавления корректора цвета в краситель)

11-7=4

11- неизменяемое число

7-желаемая глубина тона клиента (изменяется от желания клиента)

4-см. корректора цвета на 30гр. красителя (окислительная эмульсия не рассчитывается) на корректор.

В специальный блондин корректор цвета добавляют до 2-3 см. на 30гр. красителя.

Нейтральный корректор 0.

Нейтральный корректор это крем содержащий аммиак.

а)Мелирование или осветление натуральных волос.

Натуральный корректор 1 часть + окислительной эмульсии 1 часть

Время выдержки 35 минут.

Используется для получения эффекта слабого осветления или мелирования (эффект выгоревших прядей)

б)Расветление красителя

Для получения более светлых оттенков 20гр. 9.3 + 20гр. нейтрального корректора

Результат40гр 10.3

Cyber Color Milk Shake

Окрашивающая маска с полуперманентным эффектом, непревзойденная яркость, 10 фантазийных оттенков (красный, фиолетовый, синий, зеленый, золотистый, пепельный, оранжевый, желтый, розовый, коричневый) . Применяется для получения очень ярких оттенков на осветленных волосах, после окрашивания для поддержания цвета, для усиления пигмента в красителе. Personal Cyber color ухаживает за волосами в момент окрашивания, так как его активные вещества питают и увлажняют волосы в течении всего времени выдержки. Очищенные красители с интенсивными и концентрированными пигментами обеспечивают блеск и насыщение цветом.

Способ применения: нанести кисточкой на сухие или влажные волосы в чистом виде или смешать с любой маской Periche для получения прозрачных пастельных тонов. Выдержать 15-20 мин. Смыть.

Смывается через 8-12 раз.

Гель-корректор «Ледяной блондин»

Специальное средство для устранения желтого цвета после осветления или нежелательных оттенков блондированных волос без необходимости окрашивания. Наличие комплекса из четырех растительных экстрактов обогащает формулу благодаря своим успокаивающим, смягчающим и защитным свойствам. Масло ромашки, экстракт липы, лаванды и гамамелиса вирджинского.

Способ применения: Смешать КОРРЕКТОР 01 с КОРРЕКТОРОМ 02 в миске. Нанести смесь на влажные или сухие волосы. Выдержать 7-25 мин. Смыть.

Удаление цвета

Если клиент желает перейти от очень темного тона к более светлому,

необходимо применить данную технику, так как осветлить уже окрашенные

волосы при помощи одной лишь краски невозможно (основное правило: краска краску не удаляет).

Как удалять цвет.

Пропорция смешивания и время выдерживания рассчитаны с учетом

интенсивности осветления и результатами технической диагностики

(изначальный цвет волос, желаемый цвет волос, пористость волос).

Осветление до 3-4 тонов

Приготовление:

20 гр. осветляющего порошка + 60 гр.

окисляющей эмульсии 6% (20 vol).

Время выдерживания от 20 до 30 минут.

Осветляющий порошок White Color

Обесцвечивающий порошок White Color, содержит только высококачественные компоненты и обеспечивает превосходное осветление, сохраняя структуру волос. Это

универсальный продукт, который подходит для любой техники: мелирования,

создания бликов и особых эффектов осветления. Сине-фиолетовый пигмент, нейтрализует желтовато-оранжевые тона. При смешивании с окисляющей эмульсией White Color образует мягкий крем, который легко наносится и гарантирует

фантастические результаты осветления.

Метод применения и приблизительное время выдерживания:

смешайте 30 г обесцвечивающего порошка White Color с кремовой окисляющей

эмульсией в неметаллической емкости в следующих пропорциях:

Осветление на 4-5 тонов = 30 гр. осветляющего порошка + 60 г

ок.эмульсии 3; 6 %. (время воздействия 20-50 минут).

Осветление на 5-6 тонов =30 гр. осветляющего порошка + 45 г

ок.эмульсии 3; 6%. (время воздействия 20 -50 минут).

30

Осветление на 6-7 тонов =30 гр. осветляющего порошка + 30 г

ок.эмульсии 3; 6%. (время воздействия 20-50минут).

Для более деликатного осветления выбирайте более слабую окисляющую

эмульсию и разводите в соотношении 1:2. Постоянно проверяйте состояние

волос во время процедуры осветления.

Осветляющий порошок iWhite Color

без аммиака

Осветляющий порошок без аммиака. Подходит для всех техник осветления, применяемых профессионалом. Продукт по обесцвечиванию создан по новой технологии – без аммиака, что позволяет бережно относится к структуре волос. Достичь максимального осветления возможно, учитывая плотность волоса и соблюдая рекомендации по применению.

Порошок без запаха, не пылит и не наносит вреда дыхательным путям. ПРИМЕНЕНИЕ: смешать обесцвечивающий порошк в неметаллической емкости в пропорциях от 1:1 до 1:2 с окислителем эмульсионным 1,5%; 3%; 6%; 9% или 12% в зависимости от применяемой техники обесцвечивания. Перемешать до однородной массы и нанести на волосы.

Время воздействия на волосах 10-50 минут в зависимости от желаемой степени обесцвечивания.

Корректор цвета Out Colors

Коррекция цвета – это техническая операция, предназначенная для деликатного удаления искусственного пигмента с волос

Выполняется с помощью КОРРЕКТОРА ЦВЕТА от Periche Profesional

Состав из фруктовых кислот на мягкой основе с ухаживающими и смягчающими компонентами, позволяет удалить неоднородность и плотность цвета, решить проблему пятен в результате некорректного окрашивания

Декапирует на 2-3 тона, при полном сохранении естественного пигмента

Идеален для удаления ярких оттенков медных, красных, фиолетовых

Не содержит аммиак и перекись водорода

Способ применения:

составы «1» и «2» строго на весах.

  • Нанести на окрашенную часть волос кисточкой, накрыть шапочкой

  • Время воздействия 10 мин с дополнительным теплом или 15-20 мин без тепла

  • Тщательно смыть состав с волос 2-3 раза шампунем pH 5.5

  • Подсушить волосы полотенцем

  • Нанести на одну прядь 3% окислительную эмульсию на 5-7 мин., чтобы проверить, насколько хорошо удалены искусственные пигменты из волос.

  • Смыть с волос 3% окислительную эмульсию, подсушить волосы

  • Если после нанесения 3% окислительной эмульсии цвет проявился снова, по длине или на концах, повторить нанесение смеси КОРРЕКТОРА ЦВЕТА «1» и «2» на наиболее темные участки волос

  • Далее действовать по предложенной выше схеме

  • Если Вас и клиента устраивает цвет на пряди после обработки ее 3% окислительной эмульсией, можно приступать к окрашиванию

  • В прикорневой зоне работайте как обычно, по правилам окрашивания

  • Выбранный цвет красителя по длине должен быть светлее на 2 тона, чем цвет на обработанной пряди, или вместо красителя можно использовать корректор 0

  • Смешивать краситель или корректор 0 нужно с 9% окислительной эмульсией в обычной пропорции 1: 1,5

  • Время воздействия в прикорневой зоне будет обычное

  • Время воздействия по длине 10-20 мин

Пример:

Натуральный цвет волос клиента в прикоревой зоне 7/0

Цвет по длине 5/4

Желаемый цвет 7/44

1) При помощи КОРРЕКТОРА ЦВЕТА удалить пигмент с длины волос

2) Прикорневую зону окрасить цветом 7/44 + 3% в пропорции 1:1,5

3) Длину окрасить цветом 9/44 + 9% или 0/0 + 9%

Общее время воздействия: 30 минут

КОРРЕКТОР ЦВЕТА способен удалить искусственный пигмент не более, чем на 2 тона светлее

После работы с КОРРЕКТОРОМ ЦВЕТА волосы необходимо окрашивать или полностью обрабатывать 3% окислительной эмульсией, для завершения реакции окисления в волосах.

цвет волос как в палитре, выбор стойкого красителя и определение его количества для разной длины волос

Почему жжет кожу при окрашивании, какая крем-краска стойкая, сколько нужно краски и возможно ли получить цвет волос как в палитре.

Во второй части интервью с ведущим технологом “Индустрии красоты” Еленой Сливовой мы говорим о том, почему краска жжет кожу, какой краситель продержится долго и сколько краски нужно, а также возможно ли получить цвет волос как в палитре.

– Покупатели в магазинах и на форумах часто жалуются, что краска жжет при окрашивании. Почему возникают неприятные ощущения и как от них избавиться?

Ощущения на коже при окрашивании индивидуальны и зависят от особенностей кожи человека. Вероятность неприятных ощущений увеличивается, если у вас чувствительная кожа головы, есть себорея или перхоть.

Общее правило перед окрашиванием: 1-2 дня не мыть голову. Это нужно, чтобы накопить достаточно себума – естественной защиты кожи головы.

Уменьшить неприятные ощущения помогут специальные лосьоны, масла и кремы. Профессиональные бренды выпускают такие продукты под свои составы красителей. Добавлять их можно смело в смесь красителя и окислителя, без опасения за свойства крем-краски или осветляющего средства. Такие кремы и масла не теряют свойств в щелочной среде и не влияют на результат окрашивания.

Если вы используете краситель марки Elgon, выбирайте крем Color Care Lenitive Cream. Для красителей Inebrya подойдет защитное успокаивающее масло Inebrya Soothing Oil. Красители Mood можно разбавить активным защитным маслом Mood Color Assist. Данное масло подойдет для нанесения по краю роста волос на лице и на шее, чтобы темный краситель не остался на коже.

Главное, не игнорируйте неприятные ощущения! Если краска жжет во время окрашивания, а после у вас появились зуд и покраснение, следующие окрашивание делайте безаммиачным красителем с гипоаллергенным составом, например, Elgon Get the Color Dolce.

– В каких случаях для окрашивания будет достаточно одной упаковки красителя?

Если не погружаться в особенности состояния волос перед окрашиванием, то одной упаковки красителя в 60 грамм хватит на натуральные и ранее окрашенные волосы небольшой длины до плеч. Густые и пористые волосы будут требовать большего количества красителя, примерно 90 грамм или 1,5 упаковки.

Будьте готовы, что изменить цвет натуральных волос одним цветом красителя можно только на 3 тона светлее или темнее. Радикальную смену цвета волос, креативное окрашивание и другие сложные изменения тона получить при окрашивании одним оттенком не выйдет. Для такого окрашивания понадобится предварительное осветление или наоборот, насыщение волос пигментом.

– Стойкость цвета – главное требование при выборе красителя для волос. Как выбрать крем-краску, оттенок который продержится долго?

За стойкость цвета на волосах отвечает не только краситель. Насколько долго продержится оттенок, зависит от качества волос и ухода за ними. Поврежденные и пористые волосы будут быстро терять цвет. Такой же результат ждет тех, кто каждый день моет голову шампунем, не предназначенным для окрашенных волос.

Чтобы оттенок дольше сохранял свою яркость, выбирайте перманентные красители, на которых будет указана стойкость до 6-8 недель. К таким красителям относится стойкая крем-краска Elgon Get the Color Dolce и стойкая крем-краска Inebrya Color Professional.

После окрашивания используйте шампуни и кондиционеры, усиливающие оттенок и сохраняющие цвет. Например, средства из линии Elgon Colorcare и оттеночные крем-кондиционеры Elgon ICare. Если вы окрашиваете сильно поврежденные волосы, то обратите внимание на процедуру домашнего экранирования волос. Экранирование поможет восстановить волосы и защитить их цвет.

– Ну и последний, самый волнующий вопрос. Как получить цвет волос, как в палитре?

Как технолог скажу сразу: эта задача порой трудная даже для парикмахеров-стилистов, профессионально владеющих принципами колористики и окрашивания волос.

Что такое цвет волос в палитре? В каталоге мы видим прядь волос, окрашенную в какой-то оттенок. При создании каталога, пряди обесцветили до белого состояния, а затем нанесли на них краситель. Получается, что результат “как в палитре” можно получить только на волосах, полностью лишенных естественного пигмента.

Но не спешите расстраиваться или обесцвечивать волосы.

Законы колористики помогают подобрать средство и технику окрашивания так, чтобы получить нужный результат на любых волосах. Перед окрашиванием в нужный тон может понадобиться осветление или наоборот насыщение волос темным пигментом. В некоторых случаях получить цвет как в палитре поможет дополнительный оттенок в красителе. Так, например, нейтрализовать желтизну могут холодные тона.

– Где найти эти законы и как в них разобраться простому человеку?

Сейчас мы с технологами разрабатываем тесты и материалы, которые помогут научиться клиентам подбирать красители и способы окрашивания под желаемый цвет в палитре. Найти их можно будет на сайте “Индустрии красоты”.


– Елена, спасибо за беседу! Надеемся наши читатели стали ближе к безупречному самостоятельному окрашиванию волос.

Курсы колориста парикмахера | Школа красоты Beauty Art

Обучающий курс «Колорист – техник»

Длительность:
10 дней

Стоимость:
группа до 8-ми человек – 1300 руб
индивидуальное обучение до 2-х человек – 1800 руб

ПРОГРАММА

1 День. Правила Колориста. Теория 

Начало в 11-00

*Санитария и гигиена

*Введение в колористику

*Системы и группы красителей

*Математика цвета  

*Химия цвета 

*Практическая работа (Тестируем красители)

*Таблица окислителей

*Физические и химические свойства волос

*Взаимодействие красителя с разной структурой волос

*Звезда Освальда, чтение палитры

практическая работа, (Создание оттенка)

*Трехэтапная диагностика волос

*Правила разделение головы при окрашивании 

*Правильный выбор инструмента для окрашивания волос

*Правила мытья головы окрашенных волос

 

2 день. Алгоритм Колориста

*Стойкое окрашивание волос

*Правила первичного и вторичного окршивания волос

*Первичное, вторичное окрашивание  волос, смена цвета

*Правила выбора окислителя с учетом исходной базы волос и пожеланий клиента

*Правила нанесения красителя по зонам разделения

*Алгоритм окрашивания волос «от и до»

*Культура обслуживания клиента, этика и эстетика

*Решение колористических задач

*Практическая отработка на моделях

*Решение колористических задач

*Домашнее задание 

 

3 день. Тонирование

*Виды тонирования волос

*Группы красителей для тонирования

*Таблица окислителей для тонирования волос

*Правило тонирования натуральных волос

*Правило тонирования окрашенных волос

*Правило тонирования обесцвеченных волос

*Правило тонирования в пепельные оттенки

*Правила экспресс тонирования «цветовая баня»

*Правила тонирования и окрашивания волос в медно-красные оттенки

*Дуальное окрашивание волос, виды растяжки цвета

*Практическая отработка на моделях

*Решение колористических задач

*Домашнее задание 

 

4 день. Седина.

*Виды седины и методы ее окрашивания

*Правила окрашивания седых волос в натуральные оттенки

*Правила окрашивания седых волос в модные оттенки

*Правила окрашивания седых волос в оттенки блонд

*Правило пигментации

Спец формулы для окрашивания седины

*Правило окрашивания стекловидной седины

*Практическая отработка на моделях

 

5 день. Спец Блонды, Обесцвечивание волос. Техники мелирования.

*Правила осветления   волос, первичное и вторичное

*Правила первичного и вторичного обесцвечивания волос

*Продукты для обесцвечивания волос

*Схемы разделения, этапы нанесения и время выдержки обесцвечивающих продуктов

*Правило нейтрализации фонов осветления «шаг вперед»

*Определение обесцвечивания волос по шкале фонов осветления

*Правило нейтрализации остаточного пигмента

*Секреты безупречного блонда

*Правило окрашивания из блонда в натуральный

*Таблица окислителей для осветления волос

*Таблица обесцвечивания для натуральных и окрашенных волос

*Репигментация

*Виды мелирования волос. Схемы разделения и метод набора прядей.

*Практическая отработка на моделях

 

6-9  день. Авторское окрашивание волос. (Сложные техники)

*Подбор цвета волос с учетом индивидуальных особенностей клиента

Закон «цветотипов»

*Виды колорирования волос

Техника «Grunge»

*Постановка руки

*Составление формулы окрашивания с учетом дизайна цвета

*Этапы нанесения красителей в сложных техниках окрашивания волос

Все о 

«Аир Тач»

*Схемы разделения для Айр Тач

*Правила выдува и изменения визуализации света и тени окрашивания

*Способы нанесения красителей

*Рассеянный Айр Тач

*Рельефный Айр Тач

*Айр Тач с эффектом Ombre

*Из Мелирование в Айр Тач

«Shatush» и «Balayage»

*«Shatush» – схемы разделения и методы набора прядей

*Правильный начес и его разновидности 

*Экспресс техники 

*Handtouch – его разновидности 

*Комбинированные  техники (учимся совмещать)

 «Balayage» – схемы разделения и методы нанесения красителей

*Техника «свободной руки»

*Таблица обесцвечивания открытых и закрытых техник мелирования

*Практическая отработка техник на манекен головах

*Практическая отработка на моделях

 

10 день. 

*Подведение итогов 

*Теоретический экзамен

*Фуршет 

*Фотоссесия

Корректор цвета Estel Professional Essex Correct – «!ОБНОВЛЕНО:ДОБАВЛЕНА НОВАЯ ФОРМУЛА! ЦВЕТОВАЯ БАНЯ в домашних условиях синим (0/11) и зелёным (0/22) микстоном: РЕЦЕПТ с пропорциями и ФОТО»

ВСЕМ ПРИВЕТ!

 

Сегодня я хочу поделиться с вами своим опытом использования микстонов от Estel.

 

 

В этом отзыве я рассказывала о своей истории окрашивания и о классной кислотной смывке Prestige (а также о некоторых важных колористических терминах, советую почитать:), но вкратце опишу ситуацию тут:

после того, как я единожды покрасилась в брюнетку (так получилось, хотела в шатенку), я ждала вымывания цвета и окрашивала только корни. В результате почти за год длина вымылась и стал проглядывать рыжий фон осветления, но окрашивать длину я по прежнему не хотела, так как не определилась с оттенком краски и поэтому тогда я впервые начала свои опыты с синим микстоном.

 

 

Опытным путём я начала искать нужную мне пропорцию, так как вариант смешивать микстон с шампунем с окислителем к одному (1:1:1) казался мне:

а) неэкономичным и

б) что волосы уйдут в сильное затемнение и будет виден синий пигмент.

Также предвосхищая вопросы, которые могут прозвучать, я скажу, что я не применяла для рассчёта пропорции “правило 10-ти, 11-ти” и т. д., так как даже сами колористы говорят, что на практике это НЕ РАБОТАЕТ! И я с ними абсолютно согласна! Первые мои попытки закончились провалом, так как результата, кроме перевода сырья, не было никакого.

 

Поэтому попробовав несколько раз, я наконец нашла пропорцию, которая меня устроила:

  • 10 см микстона (отмеряла с помощью сантиметровой ленты)
  • 20 гр обычного шампуня
  • 20 гр 3% окислителя (лучше было бы 1,5% окислитель)

Смешивать нужно именно в такой последовательности, так как вначале между собой нужно смешать микстон и шампунь до однородности, а уже потом добавлять окислитель. Все остальные подробности чуть позже в отзыве.

 

Я осталась довольна результатом, цвет стал более спокойным, фон осветления уже так не бликовал и мне удалось сгладить почти что чёрную зону корней с рыжеватой длиной (а чёрную полосу в зоне корней я получила вследствие окрашивания моих натуральных корней 8-го УГТ краской Igora Royal 5.63, а через месяц 6.63 на 3% оксиде, представляете?!Я была ужасно расстроена и после этого решила перейти на окрашивание Estel).

Это мои фото 2-3 месячной давности.

 

А пару недель назад я воспользовалась кислотной смывкой фирмы Prestige, и получила рыжий ФО 6-го УГТ (местами 5-го).

 

 

В результате последующего окрашивания (Estel 7.1+ 6.00 для нейтрализации рыжего ФО в ту же смесь на 6% оксиде) цвет получился с краснинкой, чего я абсолютно не хотела (эххх, но это всё таки первый опыт смывки и окрашивания после)

 

 

Учитывая, что я и так получилась темнее, чем ожидала (после кислотной смывки нельзя выдерживать краситель полное время, а я об этом увы не подумала, ещё и наносила на сухие, а не влажные волосы), то и синим микстоном я не хотела пользоваться, чтобы не уйти в ещё большее затемнение, поэтому решено было пробовать зелёный!

 

И вот, как и обещала, наглядно покажу на примере зелёного микстона все свои шаги подробно:

Пропорции абсолютно те же, спрячу их в цитату:

  • 10 см микстона (отмеряла с помощью сантиметровой ленты)
  • 20 гр обычного шампуня
  • 20 гр 3% окислителя (лучше было бы 1,5% окислитель)

Вот так выглядит 10 см микстона (отмерила по 5см для удобства)

 

Смешиваем сначала с шампунем (на фото к сожалению плохо видно пластиковый! венчик для смешивания краски, который значительно облегчает процесс!!!), а потом и с окислителем и получаем это зелье

Честно говоря, зелёную жижу наносить на волосы стало почему-то стрёмно, в то время как синюю я наносила не боясь, но это всё предрассудки))

 

 

Наношу на 10 мин. на влажные чистые волосы над ванной и вспениваю как шампунь, время засекаю с помощью таймера на телефоне. Выглядит это вот так:

 

 

После выдержки моем голову ещё раз, сушим и наблюдаем результат:

 

 

До того, как я сделала фото, мне казалось что эффекта никакого нет, но сделав фото, я увидела отличный результат нейтрализации красноты!

Пока что я могу сделать вывод, что зелёный микстон не уводит в затемнение, а даже будто наоборот, мне кажется волосы стали визуально светлее.

Также мне кажется, что именно с задачей нейтрализации он работает лучше, чем синий корректор против рыжины и оранжевых нюансов, я имею в виду степень нейтрализации при одной и той же пропорции. В следующий раз думаю попробую даже пропорцию 1:1:1, потому что зелёный микстон работает эффективно, но мягко.

Я осталась очень довольна результатом, в дальнейшем хочу попробовать смесь зелёного и синего микстонов в разном соотношении, но думаю в основе будет всё-таки зелёный!

А вообще уже давненько присматриваюсь к серому микстону, но думаю он будет хорош исключительно в смеси, иначе тупо затемнит и всё.

 

В общем, в завершение хочу сказать, что мне безумно нравится принцип цветовой бани для правки цветовых нюансов и чем больше я пробую, тем больше мне нравится. Думаю вскоре я найду свою золотую рецептуру и смогу всегда поддерживать красивый оттенок волос с минимальными затратами и повреждениями для волос!

Также возьму на себя смелость допустить, что данный метод хорош для того, чтобы освежить цвет по длине, можно попробовать вместо микстона взять вашу привычную краску и нанести таким же образом, раз в 5-6 месяцев думаю будет в самый раз.

 

Я планирую обновлять свой отзыв, поэтому следите за обновлениями все те, кто интересуется данной темой.

Задавайте вопросы в комментариях, делитесь собственными открытиями, я с радостью приму участие в обсуждении!

 

ОБНОВЛЕНО 16.06.2020:

Прошло недели 2 с момента окрашивания корней в оттенок 7/1 от Estel и весь пепел с длины смылся, имеем такое ДО:

 

 

В этот раз я сделала смесь поядрёней, а именно смешала синий 0/11 микстон и зелёный в пропорции 2:1 (где-то 16 мл синего к 8 мл зелёного + 10 мл окислителя 3% + 10 мл шампуня) и получаем такое шикарное ПОСЛЕ (также обратите внимание на блеск волос, он такой у меня всегда после процедуры цветовой бани):

 

 

 

 

На данный момент, я считаю, что это ЛУЧШАЯ МОЯ ФОРМУЛА для поддержания холодного тёмно-русого оттенка БЕЗ красноты и рыжины. Хватает такой красоты на 2-3 недели, с учётом режима мытья волос через день.

 

Поэтому кто давно искал решение проблемы линяло-рыжих цветов – пользуйтесь;)

 

! ! ! ВНИМАНИЕ ! ! !

 

На моём Youtube канале появился ролик, посвящённый цветовой бане. Приглашаю к просмотру;)

[ссылка]

 

И собственно сам ролик по цветовой бане для русых волос:

[ссылка]

 

Предлагаю ознакомиться с другими моими отзывами:

Благородный тёмно-русый оттенок волос без рыжины и красноты краской Estel Essex 7/1

Идентификация украинского Qiwi кошелька за 150 грн. с помощью сервиса smartid. in. ua

Универсальная палетка теней для век Essence Witch Side

История о том, как можно испортить кожу маслами

 

ВСЕМ СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ!!!

Урок №8 Основы колористики. Применение микстонов.

ПРИМЕНЕНИЕ МИКСТОНОВ УРОК 8

Добрый день мои любимые мастера и «колористы от бога»!

Сегодня мы начинаем изучать мою самую любимую тему в парикмахерском искусстве-КОЛОРИСТИКУ!

Прошу вас изучить внимательно все материалы.

Зайти на все ссылки которые я предлагаю.

И обязательно работать с информацией!

Запись в тетрадь не отменяется!

Все возникающие вопросы пишем мне в личку.

С удовольствием отвечу!

КРАСИТЕЛИ ВТОРОГО ПЛАНА

Микстона – обязательное дополнение к парикмахерской палитре, с их помощью можно создавать новые цветовые нюансы, а главное — убирать нежелательные оттенки. Правда, чтобы быть с микстонами на «ты», нужно знать ряд технических приемов, о которых мы и расскажем в этом разделе.

Микстона — интенсивные красители, как правило, спектральных цветов: красного, синего, желтого, зеленого, фиолетового, оранжевого. Могут быть серого и розового цветов, а также бесцветными. В парикмахерской практике к использованию этих красителей прибегают в следующих случаях. 1. Для нейтрализации нежелательных оттенков или получения промежуточных цветовых нюансов. 2. Для получения более ярких насыщенных оттенков или, наоборот, для разбавления цвета. 3. Для предварительной пигментации обесцвеченных и пористых волос, насыщения их отсутствующими теплыми пигментами. В этом случае микстона используются самостоятельно или в смеси с красителями натурального ряда. Далее мы рассмотрим правила использования микстонов и подробно расскажем о нюансах их применения в первых двух случаях (процедура препигментации подробно описана в разделе «Подготовка к окрашиванию»).

НЕЙТРАЛИЗАЦИЯ НЕЖЕЛАТЕЛЬНЫХ ОТТЕНКОВ И ПОЛУЧЕНИЕ ПРОМЕЖУТОЧНЫХ ЦВЕТОВ

Прежде чем говорить о нейтрализации нежелательных оттенков, нужно понять, каким образом они появляются на волосах. Дело вот в чем. Оттенок волос складывается из двух составляющих: 1) преобладающего оттенка в волосах (натурального или косметического) и 2) оттенка выбранного красителя. При окрашивании натуральных волос цвет красителя накладывается на фон осветления, при окрашивании ранее окрашенных волос — на имеющийся косметический цвет. Появление нежелательного оттенка в большинстве случаев можно предсказать, внимательно оценив цвет волос перед окрашиванием. Рассмотрим пример. У клиентки русые волосы с золотистым оттенком, и она пришла в салон, чтобы получить пепельный оттенок. Какой результат окрашивания можно ожидать? В золотистом оттенке волос преобладает желтый пигмент — пепельный оттенок в своей основе имеет синий пигмент – желтый при смешивании с синим дает зеленый – и вот, в результате окрашивания волосы клиентки приобретают зеленый отлив. Чтобы разобраться в правилах нейтрализации нежелательных оттенков вернемся к классификации цветов и понятию цветового круга (подробнее о них читайте в разделе «Теория цвета»).

Напомним, цвета бывают ахроматические и хроматические. Ахроматические цвета («бесцветные» — греч.) – это цвета, отличающиеся друг от друга по светлоте, а именно белый, черный и все оттенки серого. Хроматические цвета – все спектральные и неспектральные цвета, кроме ахроматических. Они отличаются друг от друга по цветовому тону, насыщенности и светлоте. Их можно поделить на первичные, вторичные, третичные и т. д. Мы будем говорить о первичных и вторичных цветах. Именно к этой группе относится большинство микстонов. Первичные цвета – это цвета, которые нельзя получить при смешивании других цветов. В парикмахерской палитре первичных цвета три: красный, желтый и синий. Если взять их в большой концентрации и перемешать между собой, то получится цвет, близкий к черному. Если перемешать менее концентрированные цвета, то получится цвет, близкий к серому, то есть нейтральный.

  1. Первичные цвета

КРАСНЫЙ ЖЕЛТЫЙ СИНИЙ

  1. Вторичные цвета

ОРАНЖЕВЫЙ ЗЕЛЕНЫЙ ФИОЛЕТОВЫЙ

Вторичные цвета – это цвета, которые получаются путем смешивания двух первичных (оранжевый, фиолетовый, зеленый). Красный + желтый = оранжевый. Красный + синий = фиолетовый. Синий +желтый = зеленый. В основе правила нейтрализации нежелательных оттенков лежит закон сочетания взаимопоглощающих первичных и вторичных цветов. В цветовом круге эти цвета располагаются друг напротив друга: красный напротив зеленого, синий напротив оранжевого, желтый напротив фиолетового. При смешивании они дают нейтральный цвет, потому что содержат в себе три основных цвета, фиолетовый + желтый = красный + синий + желтый. Оранжевый + синий = желтый + красный + синий. Зеленый + красный = желтый + синий + красный.

ВЫБОР ОТТЕНКОВ ДЛЯ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ НЕЖЕЛАТЕЛЬНЫХ НЮАНСОВ

Имеющийся оттенок Из каких первичных цветов состоит Цвет, используемый для нейтрализации Результат Медь (оранжевый) Вторичный (желтый + красный) Первичный синий Нейтральный Золото (желтый) Первичный желтый Вторичный фиолетовый (красный +синий) Нейтральный Красный Первичный красный Вторичный зеленый (синий + желтый) Нейтральный Зеленый Вторичный (синий + желтый) Первичный красный Нейтральный Пепельный Первичный синий Вторичный оранжевый (желтый + красный) Нейтральный Фиолетовый Вторичный (красный + синий) Первичный желтый Нейтральный Итак, мы рассмотрели, как сочетание дополнительных цветов можно использовать для нейтрализации нежелательных оттенков. Теперь нам необходимо ответить на не менее важный вопрос – сколько микстона требуется для нейтрализации и как рассчитать его количество. Почти всегда микстон в краситель добавляется в небольшом количестве. Это количество зависит от глубины тона выбранного клиентом и мастером красителя. И рассчитывается оно по так называемому «Правилу десяти» или «Правилу одиннадцати».

Это правило звучит так: из числа 11 или 10 (выбор зависит от того, сколько основных уровней глубины тона представлено в конкретной палитре) вычитается значение уровня глубины тона выбранного оттенка. Их разница и составит то количество микстона (в сантиметрах), которое необходимо добавить в краситель. При этом следует учитывать, что таким образом количество микстона рассчитывается на 30 г красителя. 2 см микстона соответствует примерно 1 г красителя.

Это усредненное значение. Соотношение длины и веса полоски микстона зависит от его консистенции, удельной плотности и т. п.

Надо заметить, что окилитель для красящей смеси, содержащей микстон, может рассчитываться двумя способами. Первый способ учитывает наличие микстона, второй нет. Выбор способа расчета определяется рекомендациями производителя. Пример расчета микстона по «Правилу десяти»

ПРАВИЛО 10

Желаемый цвет: глубина тона 6. Большая вероятность получить нежелательный оттенок. Расчет: 10- 6 = 4. В смесь необходимо добавить 4 см микстона на 30 г краски или 8 см на 60 г краски. Если считать количество микстона не в сантимерах, а в граммах, получится примерно 4 г микстона на 60 г краски. В итоге рецептура красящей смеси будет выглядить следующим образом: 56 г краски + 4 г (или 8 см) микстона + 60 мл окислителя (при смешивании окислителя с красителем в соотношении 1:1).

ПРАВИЛО 11

Пример расчета микстона по «Правилу одиннадцати» Желаемый цвет: глубина тона 6. Большая вероятность получить нежелательный оттенок. Расчет: 11 -6 = 5. В смесь необходимо добавить 5 см (2,5 г) микстона на 30 г краски или 10 см (5 г) микстона на 60 г краски. В итоге рецептура красящей смеси будет выглядить следующим образом: 55 г краски + 5 г микстона + 60 мл окислителя. Чтобы легче было понять, как рассчитывается микстон, мы СМОТРИМ НА РАСКЛАДКУ (ПАЛИТРУ) ВЫБРАННОГО КРАСИТЕЛЯ.

Использование микстона успешно предотвращает появление нежелательного оттенка, но этим его возможности не ограничиваются.

Микстон придет на помощь и тогда, когда нежелательный оттенок уже появился и его. необходимо устранить.

В этом случае проводят процедуру, которая называется «цветовая баня»

. Для ее выполнения требуется следующая смесь: необходимый микстон смешивается с окислителем 3% и шампунем в равных частях (1:1:1). Например: 30 г микстона + 30 мл окислителя 3% + 30 мл шампуня (лучше всего – бесцветного). Эта смесь наносится на волосы по всей длине. Время воздействия составляет от 2 до 20 минут (итоговое время выдержки определяется визуально). Затем смесь смывают.

Вот таким образом микстона используются для предотвращения и удаления нежелательных оттенков.

А теперь поговорим о том, как с помощью этих красителей усилить насыщенность цвета или ослабить оттенок.

УСИЛЕНИЕ И РАЗБАВЛЕНИЕ ОТТЕНКА

Микстон в парикмахерской практике можно использовать для получения более яркого оттенка при окрашивании. Для этого в состав красящей смеси добавляют до 1/4 части микстона от общего объема красителя. Например, для получения 60 г краски потребуется: 45 г выбранного красителя + 15 г микстона нужного оттенка. В тех случаях, когда нужно разбавить оттенок, используют бесцветные корректоры.

Они бывают двух видов – безаммиачные и аммиачные. Безаммиачные корректоры служат для уменьшения насыщенности подтона красителя. Могут смешиваться с цветными микстонами для создания пастельных оттенков. Как правило, добавляются в смесь в небольшом количестве.

Аммиачные корректоры — бесцветные осветляющие кремы, которые усиливают осветляющую способность красителя и изменяют уровень глубины тона. Могут использоваться самостоятельно или в смеси с красителями палитры. Для изменения уровня глубины тона в краситель добавляют 1/3 аммиачного микстона. Смесь из 60 г красителя и 20 г бесцветного корректора позволяет поднять глубину тона на один уровень

. Как крем для осветления бесцветный аммиачный корректор используют следующим образом: препарат смешивается с окислителем 3 или 6% в пропорции 1:1. Затем смесь наносится на волосы по всем правилам окраски, выдерживается на волосах 30-40 минут и смывается. Как видите, с помощью микстонов и бесцветных корректоров можно решать самые разные задачи. Чем увереннее мастер обращается с этими красителями, тем более профессиональным и прогнозируемым становится результат окрашивания.

Просмотр видео материала по ссылкам ниже

ДОБРО ПОЖАЛОВАТЬ В МИР ЦВЕТА МОИ МАСТЕРА!

УРОК ОКОНЧЕН!

ДО НОВЫХ ВСТРЕЧ!

С уважением Ваш тренер по колористике

Орлянская Галина Николаевна!

ГБПОУ РО ПУ №7 г. РОСТОВ – НА –ДОНУ.

Новости — ООО «Ева» Образовательный центр «Агат»

30 июня

НЕ ПРОФЕССИЯ, А ИСКУССТВО
Авторский курс.

Статистика утверждает, что самый редкий цвет волос — рыжий. Во всем мире их не более 1% от общего числа живущих. Второе место занимают блондины, их насчитывается приблизительно 2%. Но если посмотреть вокруг, то рыжих и блондинов окажется намного больше, а все потому, что девушкам хочется выделяться, и они прибегают к помощи ОКРАШИВАНИЯ ВОЛОС.

Преображать девушек — настоящее искусство, и мы приглашаем освоить его на нашем НОВОМ авторском курсе Елены Смородинских «ОКРАШИВАНИЕ ВОЛОС. КОЛОРИСТИКА».

ЗА 1,5 МЕСЯЦА ВЫ УЗНАЕТЕ:

Основные законы цветоведения.
Уровень тона. Техника.
Что означают цифры на тюбике.
Что такое цветовой круг.
Процесс и стадии окрашивания в кислой среде и в щелочной среде.
Колористические задачи.
Репигментация. Среда и процесс тонирования волос, обесвечивание волос, осветление красителем.
Пигмент прямого действия. Микстона. Правило 11.
Технологии окрашивания непигментированных: седых волос, осветленных.
Диагностика состояния волос. Тест на аллергию.
Последовательность и основные способы нанесения.
Консультация.
Виды окрашиваний.
Терминология.

После получения фундаментальных знаний вам будет легко работать с любым брендом, готовить красящий состав для любого типа волос, делать окрашивание различной сложности.

Все знания закрепляем на моделях, а не на манекенах.

Продолжительность курса:
10 дней с 10:00 до 20:00
(5,6,12,13,19,20,26,27 июля, 2, 3 августа)

Обучение в группе (133 ак. часов): 18 000р
Обучение индивидуальное: 36 000р.

Обучение проходит по адресу: ул. Красноармейская, 38

По всем вопросам и для записи звоните:

+7 9090 222 985

%PDF-1.5 % 2 0 объект > эндообъект 1 0 объект >>>/BBox[0 0 792 612]/длина 161>>поток Икс [email protected]|{;A(7vW:%% :Z!)ϔI+8T р 4р=п{ /NѤ’ų!3O9)H\\s$`cr1|C конечный поток эндообъект 5 0 объект >>>/BBox[0 0 792 612]/длина 161>>поток Икс [email protected]|{;A(7vW:%% :Z!)ϔI+8T р 4р=п{ /NѤ’ų!3O9)H\\s$`cr1|C конечный поток эндообъект 7 0 объект >>>/BBox[0 0 792 612]/длина 161>>поток Икс [email protected]|{;A(7vW:%% :Z!)ϔI+8T р 4р=п{ /NѤ’ų!3O9)H\\s$`cr1|C конечный поток эндообъект 6 0 объект >>>/BBox[0 0 792 612]/длина 161>>поток Икс [email protected]|{;A(7vW:%% :Z!)ϔI+8T р 4р=п{ /NѤ’ų!3O9)H\\s$`cr1|C конечный поток эндообъект 9 0 объект >>>/BBox[0 0 792 612]/длина 161>>поток Икс [email protected]|{;A(7vW:%% :Z!)ϔI+8T р 4р=п{ /NѤ’ų!3O9)H\\s$`cr1|C конечный поток эндообъект 8 0 объект >>>/BBox[0 0 792 612]/длина 161>>поток Икс [email protected]|{;A(7vW:%% :Z!)ϔI+8T р 4р=п{ /NѤ’ų!3O9)H\\s$`cr1|C конечный поток эндообъект 3 0 объект >>>/BBox[0 0 792 612]/длина 161>>поток Икс [email protected]|{;A(7vW:%% :Z!)ϔI+8T р 4р=п{ /NѤ’ų!3O9)H\\s$`cr1|C конечный поток эндообъект 4 0 объект >>>/BBox[0 0 792 612]/длина 161>>поток Икс [email protected]|{;A(7vW:%% :Z!)ϔI+8T р 4р=п{ /NѤ’ų!3O9)H\\s$`cr1|C конечный поток эндообъект 10 0 объект >>>/BBox[0 0 792 612]/длина 161>>поток Икс [email protected]|{;A(7vW:%% :Z!)ϔI+8T р 4р=п{ /NѤ’ų!3O9)H\\s$`cr1|C конечный поток эндообъект 11 0 объект >поток 2019-08-12T17:45:19Z2016-03-30T16:37:27-04:002019-08-12T17:45:19ZAcrobat PDFMaker 10.1 для Worduuid:c24afbb4-5678-4077-ac61-b819dce1d987uuid:2e0e016f-876b-4fed-b22b-1439303cabcf

  • 4
  • приложение/pdf
  • Кевин Готье
  • Библиотека Adobe PDF 10.0; модифицировано с использованием iText 2.1.7 от 1T3XTD:20160330173000Microsoft конечный поток эндообъект 12 0 объект >поток x+*T0T0

    Окрашивание по Граму

    — StatPearls — NCBI Bookshelf

    Введение

    Окрашивание по Граму — один из наиболее важных методов окрашивания в микробиологии.Он получил свое название от датского бактериолога Ганса Кристиана Грама, который впервые представил его в 1882 году, в основном для выявления организмов, вызывающих пневмонию. Часто первый выполняемый тест, окрашивание по Граму, включает использование кристаллического фиолетового или метиленового синего в качестве основного цвета. Термином для организмов, которые сохраняют основной цвет и кажутся пурпурно-коричневыми под микроскопом, являются грамположительные организмы. Микроорганизмы, которые не поддаются первичной окраске, кажутся красными под микроскопом и являются грамотрицательными микроорганизмами.

     Первым этапом окрашивания по Граму является использование кристаллического фиолетового красителя для первоначального окрашивания предметного стекла. Следующий шаг, также известный как фиксация красителя, включает использование йода для образования комплекса кристаллический фиолетовый-йод, чтобы предотвратить легкое удаление красителя. Впоследствии для удаления красителя используется обесцвечиватель, часто растворитель этанола и ацетона. Основной принцип окрашивания по Граму заключается в способности стенки бактериальной клетки удерживать краситель кристаллический фиолетовый во время обработки растворителем.[3] Грамположительные микроорганизмы имеют более высокое содержание пептидогликана, тогда как грамотрицательные микроорганизмы имеют более высокое содержание липидов.[4] 

    Изначально все бактерии поглощают краситель кристаллический фиолетовый; однако при использовании растворителя липидный слой грамотрицательных организмов растворяется. При растворении липидного слоя грамотрицательные теряют первичную окраску. Напротив, растворитель обезвоживает стенки грамположительных клеток с закрытием пор, предотвращая диффузию комплекса фиолетового с йодом, и, таким образом, бактерии остаются окрашенными. Продолжительность обесцвечивания является критическим этапом окрашивания по Граму, поскольку длительное воздействие обесцвечивающего агента может удалить все пятна от обоих типов бактерий.[6]

    Последним этапом окрашивания по Граму является окрашивание основным фуксином для придания обесцвеченным грамотрицательным бактериям розового цвета для облегчения идентификации. Он также известен как контрастное окрашивание. Некоторые лаборатории используют сафранин в качестве контрастного красителя; однако основной фуксин окрашивает грамотрицательные микроорганизмы более интенсивно, чем сафранин. Точно так же Hemophilus spp., Legionella app и некоторые анаэробные бактерии плохо окрашиваются сафранином.

    Сбор образцов

    Для окрашивания по Граму можно использовать различные клинические образцы.Некоторыми из обычно используемых образцов являются мокрота, кровь, спинномозговая жидкость, асцитическая жидкость, синовиальная жидкость, плевральная жидкость, моча и т. д. Также можно использовать мазки из ноздрей, горла, прямой кишки, раны, шейки матки и т. д. Сбор образцов всегда должен осуществляться в стерильных контейнерах.

    Процедуры

    Типы оборудования, необходимого для окрашивания по Граму, включают:

     Реагенты, необходимые для окрашивания по Граму, включают:

    • Кристаллический фиолетовый (основной краситель) [1]
    • Раствор йода по Граму (протрава) [1]
    • Ацетон/этанол (50:50 об.:об.) (обесцвечиватель) [1]
    • 0.1 % основной раствор фуксина (контрастное окрашивание) [1]
    • Вода

    Процедура

    1. Приготовление мазка:

    • Петля для посева используется для переноса капли взвешенной культуры на предметное стекло микроскопа.

    • Если в чашке Петри или в наклонной культуральной пробирке есть колония, добавляется капля или несколько петлей воды, чтобы облегчить перенос минимального количества колонии на предметное стекло.

    • Требуется минимальное количество культуры. Если культуру можно обнаружить визуально на инокуляционной петле, это указывает на сбор слишком большого количества культуры.

    • Культуру наносят инокуляционной петлей до получения ровной тонкой пленки по кругу диаметром 15 мм. Типичное предметное стекло может содержать до 4 небольших мазков при исследовании более чем одной культуры.

    • Предметное стекло можно сушить на воздухе или с помощью нагревания над нежным пламенем.Предметное стекло следует перемещать по кругу над пламенем, чтобы предотвратить перегрев или образование кольцевых узоров на предметном стекле. Тепло способствует адгезии клеток к предметному стеклу и предотвращает значительную потерю культуры во время промывания.

    2. Окраска по Граму:

    • На фиксированную культуру наносится краситель кристаллический фиолетовый.

    • Через 10–60 секунд краситель смывается, а излишки красителя смываются водой. Цель состоит в том, чтобы смыть пятно без потери фиксированной культуры.

    • Раствор йода используется для покрытия мазка на 10-60 секунд. Этот шаг известен как «фиксация красителя». Раствор йода сливают, предметное стекло промывают проточной водой. Избыток воды с поверхности стряхивается.[7]
    • На предметное стекло добавлено несколько капель обесцвечивающего средства. Обесцвечиватели часто представляют собой смешанный растворитель этанола и ацетона. Этот этап известен как «обработка растворителем». Предметное стекло промывают водой в течение 5 секунд. Чтобы предотвратить чрезмерное обесцвечивание грамположительных клеток, прекратите добавлять обесцвечивающий агент, как только растворитель перестанет окрашиваться при протекании по предметному стеклу.

    • Мазок докрашивают основным раствором фуксина в течение 40–60 секунд. Раствор фуксина смывают водой, а избыток воды промокают салфеткой. Слайд также можно высушить на воздухе после стряхивания лишней воды.

    3. Микроскопия предметного стекла:

    • Предметное стекло следует исследовать под микроскопом в иммерсионном режиме.

    • При первоначальном исследовании слайдов следует использовать объектив X40 для оценки распределения мазка, а затем их следует исследовать с использованием масляного иммерсионного объектива X100.

    • Все участки предметного стекла требуют первоначального осмотра. Области толщиной всего в одну клетку должны быть исследованы. Толстые области на слайдах часто дают переменные и неправильные результаты.

    • Окрашивание лейкоцитов и макрофагов Грамотрицательные.

    • Клетки плоского эпителия окрашиваются грамположительно.

    Используются различные модификации окрашивания по Граму, такие как окрашивание по Граму Аткина, окрашивание по Граму Берка и т. д.[8]

    Возможный диагноз

    Окрашивание по Граму помогает в диагностике заболевания или патологического состояния.

    Примеры грамположительных микроорганизмов: 

    • COCCI

    • COCCI: STAPHYLOCOCCUS Вид, и Стрептококк Виды

    • Bacilli: Corynebacterium 20020 Виды, Виды Clostridium , и Виды Listeria

    • Примеры грамотрицательных организмов [9] :
    • COCCI:

    • CACCI: Neisseria Gonorheae, Neisseria MeningItidis, и Moraxella Виды

    • Bacilli: Escherichia Coil, Pseudomonas видов, Proteus видов и Klebsiella вид

    • Примеры грамма вариабельные микроорганизмы включают:

    • Actinomyces видов

    Нормальные и критические результаты

    Нормальным результатом в стерильной жидкости организма должно быть отсутствие каких-либо патологических организмов в мазке.Организмы идентифицируются по цвету и форме. Грамположительные микроорганизмы имеют пурпурную или синюю окраску, а грамотрицательные — розовую или красную. Бациллы имеют палочковидную форму, а кокки – сферическую.

    Выводы при окрашивании по Граму, указывающие на лежащую в основе бактериальную инфекцию:

    • Грамположительные кокки в скоплениях: обычно характерны для видов Staphylococcus , таких как S. aureus.

    • Грамположительные кокки в цепочках: обычно характерны для видов Streptococcus , таких как S.pneumoniae, стрептококки группы В

    • Грамположительные кокки в тетрадах: обычно характерны для Micrococcus spp.

    • Грамположительные бациллы, густые: обычно характерны для Clostridium spp., например C. perfringes , C. septicum .

    • Грамположительные палочки, тонкие: обычно характерны для Listeria spp.

    • Грамположительные палочки разветвленные: обычно характерны для Actinomyces и Nocardia .

    • Грамотрицательные диплококки: обычно характерны для Neisseria spp., например N. meningitidis .

    . : обычно характерны для Acinetobacter spp., и они могут быть грамположительными, грамотрицательными или грамвариабельными.

  • Грамотрицательные палочки, тонкие: обычно характерны для Enterobacteriaceae , например E. coli .

  • Коккобациллы: обычно характерны для видов Hemophilus , таких как H. influenzae .

  • Изогнутый: обычно характерен для Vibrio spp.,; Campylobacter spp., такие как V. cholerae и C. jejuni .

  • Форма тонкой иглы: обычно характерна для Fusobacterium spp.

  • Грамвариабельные организмы: эти организмы не группируются ни в грамположительные, ни в грамотрицательные организмы.

    Мешающие факторы

    Если образец нестерильный, образец может быть контаминирован несколькими микроорганизмами. Точно так же неправильный сбор образцов и предшествующее использование антибиотиков могут помешать росту микроорганизмов. Во время интерпретации окраски по Граму, как описано Всемирной организацией здравоохранения в 2003 г., необходимо выполнить следующие шаги:

    1.Общий характер мазка требует анализа при малом увеличении (10X)

    • Фон предметного стекла обычно должен быть грамотрицательным или прозрачным

    • Лейкоциты, если они присутствуют, должны окрашиваться как грамотрицательные bacillus бактерии

    • Мазок должен быть толщиной в одну клетку без перекрытия клеток

    2.Следует использовать малое увеличение, чтобы отметить следующее:

    • Относительное количество полиморфноядерных нейтрофилов (PMNs), мононуклеарных клеток и эритроцитов (RBCs)

    3. Иммерсионное обследование нескольких месторождений необходимо учитывать следующее:

    • Микроорганизмы: если идентифицированы, укажите количество и морфологию и уплощенная

    • Внешний вид сторон: параллельный, яйцевидный, неправильный или вогнутый

    • Ось организма: прямая, изогнутая или спиральная

    • Плеоморфизм (изменчивость формы)

      7

    • 4 расширения

    Осложнения

    Интерпретация препаратов может быть затруднена, если микроскопический мазок густой и слипшийся.Время обесцвечивания следует очень тщательно контролировать, чтобы избежать недостаточного или чрезмерного обесцвечивания. Более толстые мазки требуют более длительного времени обесцвечивания. Точно так же культуры должны подвергаться оценке, пока они еще свежие. Старые культуры, как правило, теряют пептидогликановые клеточные стенки, что предрасполагает грамположительные клетки к грамотрицательным или грамвариабельным. Окрашивание по Граму бесполезно для организмов без клеточной стенки, таких как виды Mycoplasma , и для более мелких бактерий, таких как виды Chlamydia и Rickettsia .

    Окрашивание по Граму не может ложно выявить микроорганизмы в следующем сценарии:

    • Использование антибиотиков до сбора образца

    • Неуместной возраст культуры: слишком молодые или слишком старые

    • , фиксируя мазок до его сухого

    • Мазок слишком толстый

    • низкая концентрация Из хрусталя Violet

    • Недостаточное воздействие на йод

    • Чрезвычайшие отчетные

    • Отсутствие опыта в подготовке слайда, и просмотр слайда

    Иногда результаты окрашивания по Граму могут не совпадать с окончательными результатами посевов и потенциально могут привести к ненадлежащему использованию антибиотиков.[10]

    Клиническое значение

    Окрашивание по Граму часто является начальным диагностическим тестом для оценки инфекций. Использование окраски по Граму облегчает быстрое применение соответствующих антибиотиков. Однако генетические последовательности и молекулярные методы более специфичны, чем классическое окрашивание по Граму.

    Ссылки

    1.
    BARTHOLOMEW JW, MITTWER T. Окрашивание по Граму. Bacteriol Rev. 1952 Mar; 16(1):1-29. [Бесплатная статья PMC: PMC180726] [PubMed: 14925025]
    2.
    О’Тул, Джорджия. Классический обзор: как работает окраска по Граму. J Бактериол. 2016 01 декабря;198(23):3128. [Бесплатная статья PMC: PMC5105892] [PubMed: 27815540]
    3.
    LIBENSON L, McILROY AP. О механизме окрашивания по Граму. J заразить дис. 1955 г., июль-август; 97 (1): 22–6. [PubMed: 13242849]
    4.
    ШУГАР Д., БАРАНОВСКАЯ Дж. Исследования по окрашиванию по Граму; Значение белков в реакции Грама. Acta Microbiol Pol (1952). 1954;3(1):11-20. [PubMed: 13147751]
    5.
    HASLETT AS. Химическое значение теста Грама для бактерий. Aust J Sci. 1947 21 июня; 9 (6): 211. [PubMed: 20255991]
    6.
    Попеску А., Дойл Р.Дж. Окраска по Граму спустя более века. Биотехнологический гистохим. 1996 г., май; 71 (3): 145–51. [PubMed: 8724440]
    7.
    MITTWER T, BARTHOLOMEW JW, KALLMAN BJ. Механизм реакции Грама. II. Функция йода в окраске по Граму. Технология окрашивания. 1950 окт; 25 (4): 169-79. [PubMed: 14782050]
    8.
    Уилсон М.Л. Клинически значимая, рентабельная клиническая микробиология. Стратегии сокращения ненужного тестирования. Ам Джей Клин Патол. 1997 г., февраль; 107 (2): 154–67. [PubMed: 64]
    9.
    Беверидж Т.Дж., Дэвис Дж.А. Клеточные реакции Bacillus subtilis и Escherichia coli на окраску по Граму. J Бактериол. 1983 г., ноябрь; 156 (2): 846-58. [Статья бесплатно PMC: PMC217903] [PubMed: 6195148]
    10.
    Rand KH, Tillan M. Ошибки в интерпретации окрашивания по Граму из положительных культур крови.Ам Джей Клин Патол. 2006 ноябрь; 126 (5): 686-90. [PubMed: 17050065]

    Протокол, рекомендации, шаги и многое другое

    Окрашивание гематоксилином и эозином дает исчерпывающую картину микроанатомии органов и тканей. Гематоксилин точно окрашивает ядерные компоненты, включая гетерохроматин и ядрышки, а эозин окрашивает цитоплазматические компоненты, включая коллагеновые и эластические волокна, мышечные волокна и эритроциты. В высококачественном окрашивании гематоксилином и эозином наблюдаются тонкие различия в оттенках цвета, создаваемых пятнами, особенно эозином, и это помогает в обнаружении и интерпретации морфологических изменений, связанных с заболеванием.

    Важно, чтобы люди, выполняющие и оценивающие качество окрашивания гематоксилин-эозином, знали о тонкостях окрашивания, знали, чего можно достичь, когда окрашивание выполняется надлежащим образом с использованием высококачественных реагентов, и знали, что искать под микроскопом. Поддержание стабильных, высококачественных красителей гематоксилин-эозином является фундаментальным требованием в гистопатологических лабораториях.

    В следующих разделах описаны основные этапы окрашивания H&E.

    Удаление воска

    После подготовки парафинового среза все элементы пропитывают и окружают парафиновым воском, который является гидрофобным и непроницаемым для водных реагентов.Большинство клеточных и тканевых компонентов не имеют естественного цвета и не видны. Первым шагом в окрашивании H&E является растворение всего парафина ксилолом (углеводородным растворителем).

    Увлажнение секции

    После тщательной депарафинизации предметное стекло пропускают через несколько смен спирта для удаления ксилола, затем тщательно промывают водой. Срез теперь гидратирован, так что водные реагенты легко проникают в клетки и тканевые элементы.

    Нанесите ядерный краситель гематоксилин

    Предметное стекло теперь окрашено ядерным красителем, таким как гематоксилин Харриса, который состоит из красителя (окисленный гематоксилин или гематеин) и протравы или связующего агента (соли алюминия) в растворе.Первоначально это окрашивает ядра и некоторые другие элементы в красновато-фиолетовый цвет.

    Завершите ядерное пятно с помощью «Воронения»

    После промывки в водопроводной воде срез «вороняют» обработкой слабощелочным раствором. На этом этапе гематоксилин окрашивается в темно-синий цвет. Теперь срез можно промыть и проверить, правильно ли окрашены ядра, демонстрируя адекватный контраст, и оценить уровень фонового окрашивания.

    Удаление избыточного фонового пятна (дифференциация)

    В большинстве случаев при использовании гематоксилина Харриса требуется этап дифференциации (обесцвечивания) для удаления неспецифического фонового окрашивания и улучшения контраста.Используется слабокислый спирт. После такой обработки снова требуется воронение и тщательное полоскание. Методы окрашивания, включающие стадию обесцвечивания или дифференциации, называются «регрессивными» окрашиваниями.

    Нанесение контрастного красителя Eosin

    Теперь срез окрашивают водным или спиртовым раствором эозина (в зависимости от личных предпочтений). Это окрашивает многие неядерные элементы в разные оттенки розового.

    Промывка, обезвоживание, очистка и установка (нанесение покровного стекла)

    После окрашивания эозином предметное стекло несколько раз сменяют спирт, чтобы удалить все следы воды, затем промывают в нескольких ваннах с ксилолом, который «очищает» ткань и делает ее полностью прозрачной.Наносится тонкий слой полистироловой среды, а затем покровное стекло. Если окрашивание и все последующие этапы были выполнены правильно, предметное стекло выявит все важные микроскопические компоненты и будет стабильным в течение многих лет.

    ДОМАШНИЙ РЕМОНТ; Типы морилок и их применение

    МНОГИЕ столяры не одобряют использование морилок для окрашивания древесины. Они считают, что его слишком часто используют, чтобы замаскировать некачественную и неинтересную древесину (сосна или тополь), чтобы она больше походила на высококачественную древесину (грецкий орех или красное дерево).Тем не менее, многие профессиональные краснодеревщики и мебельщики считают, что существует ряд законных причин для окрашивания древесины морилкой.

    Древесина часто имеет светлые участки, которые сильно контрастируют с более темными областями. Окрашивание можно использовать, чтобы сблизить крайности для большей гармонии.

    Морилка

    также может быть использована для тонкого изменения тона дерева. Томас Чиппендейл, например, часто использовал морилку цвета грецкого ореха, пытаясь приглушить красноватый оттенок красного дерева.

    Морилка также может использоваться для маскировки того факта, что для изготовления одного предмета мебели использовались разные породы дерева, например, стул Windsor с сиденьями из мягких пород дерева; подлокотники, ножки и подрамники из клена; и гребни гикори или белого дуба. Реставраторы часто используют морилку при изготовлении запасных частей, таких как передняя часть ящика или ножка. Они окрашивают новоиспеченный предмет, чтобы он соответствовал оттенку окружающего дерева.

    Наконец, морилка также может быть эффективным средством защиты древесины.Морилки для наружных работ можно использовать для защиты древесины от вредного воздействия ультрафиолетовых лучей солнца, а также от насекомых и грибков.

    Морилка может быть определена как любое прозрачное или полупрозрачное вещество, используемое для окрашивания древесины. В отличие от краски, которая имеет пигмент, взвешенный в связующем веществе, красящее вещество в морилке представляет собой краситель, растворенный в жидкости. Таким образом, краска проникает в волокна древесины, а не остается на поверхности, как краска.

    Некоторые красители являются просто красителями; другие изготовлены из полиуретана или лака, так что окрашивание и отделка могут быть объединены в одну операцию.Одним из недостатков использования красителей для отделки является то, что часть цвета останется в отделке. Таким образом, если отделка отслаивается или стирается, цвет останется с ней, оставив светлое пятно, контрастирующее с остальной частью дерева.

    Масляные пятна наиболее распространены. Жидкий растворитель обычно представляет собой петролейный спирт. В большинстве составов также есть связующее вещество, удерживающее пигмент в древесине после испарения растворителя. Масляные пятна следует наносить только в один слой; в противном случае связующее будет накапливаться и создаст лакообразную отделку.

    Различные оттенки и оттенки могут быть получены путем смешивания различных цветов морилки. Однако, если вы попытаетесь это сделать, избегайте смешивания различных марок, потому что ингредиенты в масляных красках не всегда совместимы между марками. Морилки на масляной основе легко доступны в большинстве магазинов красок и хозяйственных товаров; по этой причине они обычно являются первым выбором для мастеров-самоучек.

    Морилки на водной основе быстро сохнут (это может быть недостатком, если вы окрашиваете большие поверхности) и дают более мягкие цвета, чем морилки на масляной основе, но они имеют тенденцию поднимать текстуру древесины.Обычно после их нанесения необходимо отшлифовать поверхность. Традиционные морилки на водной основе не имеют связующего вещества и могут наноситься последовательными слоями для создания более темных оттенков. Новые красители на водной основе содержат акриловые полимерные связующие.

    Анилиновые красители производятся из каменноугольной смолы. Обычно они продаются в виде порошка и должны быть смешаны либо с нефтяными растворителями, либо с водой. Они доступны в широком диапазоне цветов и могут быть легко смешаны, чтобы соответствовать практически любому существующему оттенку.По этой причине их предпочитают реставраторы или производители, стремящиеся создать драматические цветовые эффекты. Анилиновые красители имеют очень короткое время действия; большинство профессионалов наносят их распылением.

    Химические вещества также можно использовать для окрашивания древесины, но, строго говоря, они не являются морилками. Они меняют цвет древесины в результате химической реакции, а не проникающего красителя. Бихромат поташа, соли железа, аммиак и каустическая сода являются химическими веществами, наиболее часто используемыми для окрашивания древесины. В отличие от красителей, цвет химического раствора не имеет отношения к окончательному цвету древесины.Единственный способ увидеть цветовой эффект — нанести химикат на кусок обрезков дерева. С химическими агентами трудно работать, и они не являются хорошим выбором для самодельщиков.

    Морилку наносить несложно, но необходимо соблюдать осторожность, чтобы окончательный цвет был равномерным и без полос. Для достижения наилучших результатов морилку следует наносить кистью (кистью, предназначенной исключительно для морилки) в направлении волокон. Окрасить всю поверхность; затем используйте безворсовую тряпку, смоченную в морилке и отжатую, чтобы вытереть излишки.Всегда работайте с зерном. Дайте пятну высохнуть перед нанесением финишного покрытия.

    Границы | Компьютерное моделирование многоцветного окрашивания Brainbow и клональной эволюции В-клеток в зародышевых центрах

    1. Введение

    Постоянная многоцветная рекомбинация клеток позволяет следить за судьбой окрашенных клеток. Cre-зависимая рекомбинация цветов на основе репортерной конструкции флуоресцентного белка Brainbow была применена в последние годы к нервной системе (1–4) и к биологии развития (5, 6).Поскольку принятый цвет передается потомству клетки, этот метод позволяет не только проследить судьбу самой окрашенной клетки, но и визуализировать клеточное деление и судьбу дочерних клеток. Это особое свойство аллеля brainbow сделало его пригодным для изучения эволюционных систем, таких как реакция зародышевого центра (GC) (7), которая является важной частью острого иммунного ответа на патогены (8, 9). В то время как полный репертуар GC B-клеток может быть оценен в будущем в определенные моменты времени путем секвенирования, метод мозговой дуги может использоваться для мониторинга эволюции клонов BC в GCs с течением времени (10).

    Реакции

    GC играют центральную роль не только в очистке от инфекций, но и в формировании иммунной памяти. Как таковые, они составляют основу успеха вакцинации и играют центральную роль в профилактике заболеваний. Фундаментальным принципом реакции ГК является эволюционный процесс в масштабе нескольких недель внутри живого организма в лимфоидных органах. Там В-клетки делятся и мутируют (11), а затем подвергаются процессу селекции, приводя к образованию высокоаффинных антител в ответ на патогенную провокацию.Появляющиеся В-клетки кодируют другое антитело, чем их аналоги зародышевой линии, с лучшими свойствами связывания с патогеном. Реакция ГК также отвечает за диверсификацию пула антител, готовых бороться со следующей инфекцией.

    Эволюцию В-клеток в GC трудно контролировать. Одной из возможностей является секвенирование всех В-клеток в разные моменты времени реакции (7, 12). Многоцветная рекомбинация В-клеток несет информацию о клональной эволюции В-клеток и, таким образом, позволила бы нам узнать об отборе и диверсификации В-клеток.Недавние эксперименты с использованием этого подхода показали, что В-клетки оптимизированы не только для высокой аффинности к патогену, как это широко принято, но и для оптимального разнообразия антител (7), что также подтверждается моделированием (13). Здесь мы анализируем предсказательную силу измеренных цветовых распределений для таких свойств реакции GC, как клональное доминирование и диверсификация.

    2. Методы

    Реакции in silico GC, используемые в качестве основы настоящего анализа клональности В-клеток, полностью описаны в дополнительных материалах.Архитектура модели представляет собой стохастический генератор событий с клеточными агентами в трехмерном дискретном пространстве. Он дополняется системой реакции-диффузии хемокинов, которые генерируются и воспринимаются клеточными агентами. Кроме того, каждый клеточный В-клеточный агент имеет положение в пространстве формы, которое отражает его сходство с антителом, которое оптимально связывается с рассматриваемым антигеном. Соматическая гипермутация моделируется как смещение в этом пространстве формы. Все агенты двигаются в соответствии с опубликованными двухфотонными измерениями.Они взаимодействуют в соответствии с современной современной моделью того, как развивается созревание аффинности GC B-клеток. Такие события, как движение, деление, взаимодействие и выбор, основаны на вероятностях, полученных по скорости, на временной шаг, если не указано иное (см. Дополнительный материал). Возможными судьбами В-клеток являются апоптоз, дифференцировка в выходные клетки или рециркуляция в фенотип DZ (14, 15). Моделирование воспроизводит кинетику популяции, созревание аффинности и продукцию выходных клеток в соответствии с экспериментальными ограничениями.

    Ранее опубликованная модель (16) была скорректирована за счет значительно большего количества клеток-основателей (7) и дополнена динамическим числом делений (DND), в котором говорится, что В-клетки, получающие больше сигналов от Т-фолликулярных хелперных клеток, будут разделить больше (16–18).

    2.1. Увеличение количества ячеек-основателей

    Путем экстраполяции количества различных клонов-основателей, обнаруженных при секвенировании случайно выбранных В-клеток GC, на реальное количество клонов-основателей GC (7) старая картина олигоклонального GC (12, 19) была пересмотрена.Вместо этого количество клонов-основателей было оценено в пределах 100 клеток (7). Моделирование GC (16) необходимо соответствующим образом пересмотреть. Вслед за Meyer-Hermann и Binder и Meyer-Hermann предполагается непрерывный приток новых клеток-основателей в течение первых дней после начала GC (17, 20). Хотя скорость притока клеток-основателей GC в настоящее время неизвестна, в нашей модели мы предположили, что 2 клетки в час ограничиваются первыми 4 днями реакции GC, которая генерировала количество клеток-основателей, согласующееся с Tas et al.(7). Это значение также можно оценить с помощью простой модели ODE (см. Дополнительную информацию: Скорость притока В-клеток ).

    2.2. Цветовые вероятности

    Аллель brainbow, реализованный в аллеле Rosa26 Confetti (1), случайным образом помечает клетки одним из 4 разных цветов. Применяя это к обоим аллелям В-клеток GC, В-клетки окрашиваются в одну из 10 различных цветовых комбинаций (7). Рекомбинацию можно вызвать перед реакцией GC или инъекцией тамоксифена.Чтобы смоделировать динамику цвета в GC in silico , вероятность каждой цветовой комбинации была определена как среднее значение по всем GC в экспериментах AID-KO, в которых мутация и отбор подавлены в GC (таблица 1). Были приняты вероятности окрашивания 4 цветов в silico . Эти значения использовались во всех симуляциях, если не указано иное.

    Таблица 1 . Вероятность окрашивания В-клеток одним из 4 или 10 цветов.

    2.3. Отсроченное действие тамоксифена

    Инъекция тамоксифена вызывает рекомбинацию Cre-lox одного или двух аллелей. Затем клетка GC B экспрессирует одну из десяти возможных цветовых комбинаций. Тамоксифен-активность продолжается в течение конечного времени. Предполагался экспоненциальный спад тамоксифена и, следовательно, вероятности рекомбинации in silico . Начальная вероятность p окрашивания, 0 индуцированной тамоксифеном рекомбинации неизвестна. Он был выбран таким, чтобы экспериментально наблюдаемая фракция окрашенных клеток f окрашивалась , которая известна из эксперимента (см. табл. 1, один минус черный).

    Исходная вероятность рекомбинации p окраски, 0 после введения тамоксифена оценивается с помощью упрощающей модели. Окрашивание инициируется при моделировании с временными шагами Δ t окрашивание . При времени распада тамоксифена τ тамоксифена долю окрашенных клеток можно приблизительно представить как:

    fstained=pstain,0Δtstain∫0∞exp(-tτtamoxifen)dt                  =pstain,0Δtstainτtamoxifen. (1)

    Обратите внимание, что это верно только для вероятностей p окрашивания, 0 , достаточно малых, чтобы можно было пренебречь двойным окрашиванием.

    По практическим соображениям действие тамоксифена было остановлено в момент времени τ stainstop . Это изменяет уравнение (1) на

    . fstained=pstain,0Δtstain∫0τstainstopexp(-tτtamoxifen)dt                  =pstain,0Δtstainτtamoxifen(1-exp(-τstainstopτtamoxifen)). (2)

    Это условие приблизительно соответствует исходной вероятности окрашивания p пятно, 0 от до

    pstain,0Δtstain=fstainedτtamoxifen(1-exp(-τstainstopτtamoxifen)). (3)

    Это соотношение использовалось в моделировании для фиксации окрашивания p , 0 с τ тамоксифеном = 24 ч, τ stainstop = 2 дня и f , окрашенным в черный цвет, равным 1 минус минус 12. Таблица 1.Чтобы сэкономить время вычислений при моделировании, процедура окрашивания вызывается с Δ t пятно = 1 час. При моделировании цвет приписывается клетке только один раз, если не указано иное, т. е. в случае попытки восстановить уже окрашенную клетку эта попытка игнорируется.

    3. Результаты

    3.1. Корреляция клонального и цветового доминирования

    Известно, что высокоаффинные В-клетки возникают в результате реакции GC в процессе циклов мутации и отбора.Динамика клональной селекции и сдвиг в сторону высокоаффинных клонов в ходе реакции недавно была проанализирована с помощью случайного присвоения окраски либо клеткам-основателям GC, либо клеткам GC B в ранней фазе реакции (7). Это позволило им отслеживать В-клетки GC определенного цвета и было интерпретировано как предоставление информации о клональной эволюции В-клеток GC. В частности, наибольшая фракция клеток, окрашенных одним цветом, за исключением цветового доминирования , рассматривалась как мера клонального доминирования , т.е.е., самая большая фракция клеток GC, происходящих из одного клона (см. Таблицу 2). 100%-ное клональное доминирование будет соответствовать тому, что все В-клетки GC происходят из одного клона, что является результатом сильной селекции предпочтительного клона. Чем меньше клональное доминирование, тем больше разных клонов В-клеток сосуществует в одном и том же GC.

    Таблица 2 . Определение терминологии, используемой повсюду.

    Здесь мы воспроизводим эти эксперименты in silico и определяем, при каких условиях эволюция клонального и цветового доминирования в GC коррелирует, и очерчиваем пределы этого соответствия в качестве ориентира для будущих экспериментов.Анализ был ограничен доминирующим цветом, потому что в наших руках включение второго наиболее доминирующего цвета не улучшило результаты.

    3.2. Окрашивание клеток-основателей

    В условиях, когда В-клетки окрашиваются до реакции GC, большинство В-клеток, попадающих в GC, уже имеют окраску (столбец в таблице 1 ). Это соответствует спонтанной рекомбинации В-клеток у мышей Mx1-Cre в Tas et al. (7) и позволяет отслеживать клональную эволюцию внутри GC-реакций на основе эволюции доминирования цвета.Однако это зависит от хорошей корреляции между клональным и цветовым доминированием. Мы воспроизвели цветовую динамику в silico (рис. 1А). Доминирование цвета начинается с базового уровня, который в основном отражает распределение вероятности получения разных цветов (таблица 1). Примерно на 5-й день после начала ГК ГК заметно различаются по доле клеток, экспрессирующих доминирующий цвет, что происходит во время после экспансии В-клеток, когда давление отбора на ГК становится сильным.Разнообразие цветового доминирования достигает уровня насыщения примерно на 8-й день после начала GC, что совпадает со временем, связанным со временем, связанным с захватом высокоаффинных клонов (21), и сохраняется к концу реакции GC.

    Рисунок 1 . Окрашивание клеток-основателей GC гарантирует хорошую корреляцию цвета и клонального доминирования. Клетки-основатели GC окрашивали 10 цветами перед реакцией GC. Размер самого большого цвета (A) (первые 100 из 1000 GC-симуляций) и его корреляция с клональным доминированием (B) отслеживались в течение продолжительности реакций GC.Влияние введения порога окрашивания на корреляцию было проверено в (B) (цвета). Коэффициент корреляции Пирсона от 1000 in silico GCs. 95% приблизительные доверительные интервалы для корреляции момента произведения Пирсона были рассчитаны с использованием преобразования Фишера. Распределение цветового (красный) и клонального (черного) доминирования показано на 2-й день (C) и 13-й день (D) после начала GC.

    В моделировании также известна полная информация о клональной эволюции, что позволяет нам определить степень корреляции между цветом и клональным доминированием (рис. 1В).Корреляция достаточно сильна, чтобы допустить связь клональности с преобладанием цвета. Было проверено, изменит ли корреляцию введение порогового уровня окрашивания для каждого включенного в анализ GC. Уровень корреляции был довольно независимым от этого порога (рис. 1В).

    Эта корреляция может быть подтверждена явным сравнением окраски и клонального доминирования (рис. 1C,D). Во время размножения на 2-й день после начала GC В-клетки только делились и мутировали, но только в редких случаях подвергались процессам селекции.Как следствие, клональное доминирование довольно низкое, а цветовое доминирование отражает вероятность окрашивания. Оба пика четко разделены. Позже, на 13-й день после начала GC, когда созревание аффинности завершено, оба распределения в значительной степени перекрываются. Однако также можно увидеть, что доминирование цвета имеет тенденцию переоценивать клональное доминирование.

    3.3. Тамоксифен-индуцированное окрашивание клеток

    Затем мы исследовали приписывание цвета В-клеткам на 2-й день после начала GC, что соответствует индуцированным тамоксифеном рекомбинациям у мышей AID-CreERT2 (7).На 2-й день реакции клоны-основатели уже размножались и диверсифицировали кодируемый ими В-клеточный рецептор за счет соматических гипермутаций. Это приводит к случайному окрашиванию множества копий клеток, происходящих от одного и того же исходного клона-основателя. Таким образом, корреляции цвета клеток с клонами В-клеток не ожидается.

    Эволюция доминирования цвета в silico и в естественных условиях сравнивается на рисунке 2A. Как и на рисунке 1A, преобладание цвета начинается с базовой линии и увеличивается с течением времени.Хотя общее согласие между теорией и экспериментом убедительно, существует небольшое подмножество симуляций ГХ с более высоким преобладанием цвета на 5-й и 7-й дни после тамоксифена. Это может быть намеком на переоценку давления отбора или разнообразия GC in silico . Обратите внимание, что количество GC silico выше, чем in vivo в оба дня.

    Рисунок 2 . Прогнозирование окрашивания, вызванного тамоксифеном. (A) Эволюция доминирования цвета в ответ на окрашивание, индуцированное тамоксифеном.Тридцать симуляций (черные открытые квадраты) сравниваются с экспериментальным преобладанием цвета за рисунком 3F в Tas et al. (7) (закрашенные красные квадраты). Корреляция между линейным доминированием и цветовым доминированием (B) или (C) произведением цветового доминирования и цветовой плотности (PDD). Выделяли разные пороги окрашивания (цвета линий). После индуцированного тамоксифеном окрашивания, как показано в таблице 1, В-клетки GC окрашивали на 2-й день после начала развития GC 10 цветами. Коэффициент корреляции Пирсона от 1000 in silico GCs.95% приблизительные доверительные интервалы для корреляции момента произведения Пирсона были рассчитаны с использованием преобразования Фишера.

    Каждая из

    В-клеток, окрашенных в ходе реакции, образует новый клон. Эволюция цветов теперь интерпретируется, чтобы предоставить информацию об эволюции этих родословных. Действительно, существует корреляция между доминированием цвета и линии (рис. 2В, красная линия). Однако он значительно слабее, чем при окрашивании клеток-основателей, и ограничивает интерпретацию данных об эволюции доминирования цвета.

    3.3.1. Порог окрашивания гарантирует корреляцию цвета и преобладания линии

    Мы искали возможный фильтр для данных in silico GC, который улучшает корреляцию между происхождением и доминированием цвета. Учитывая, что большая часть, в диапазоне 50% линий, не окрашивается тамоксифеном in silico и in vivo , существует значительная часть GC, в которых преобладает черная линия. Это приводит к недооценке преобладания линии преобладанием цвета.Действительно, введение порога окрашивания, т. е. минимальной доли всех окрашенных клеток в каждом in silico GC, которая должна быть достигнута для включения GC в анализ, существенно увеличивает корреляцию между клоном и преобладанием цвета (рис. 2В, синие и пурпурные линии). Однако уровень корреляции все же был несопоставим с наблюдаемым при окрашивании клеток-основателей перед входом в реакцию GC.

    Линейное доминирование также (слабо) коррелирует с долей окрашенных клеток в GC (рис. S2), называемой далее плотностью окраски (см. табл. 2), при условии, что установлен порог окрашивания.Это происходит потому, что фракция окрашивания выше начального среднего уровня окрашивания более вероятна для GC с высоким доминированием клонов. Мы проверили степень корреляции между доминированием линии и произведением доминирования цвета и плотности цвета, кратко обозначенной как PDD в следующем (рис. 2C). PDD аппроксимирует нормализованную оценку плотности (NDS), которая использовалась in vivo и определяется как произведение преобладания цвета на плотность окрашенных клеток в темной зоне, измеренную как количество окрашенных клеток на 10 мкм 2 (7 ).В то время как в ГК с низкой плотностью окраски (желтая, оранжевая и красная линии) корреляция еще слабее, порог окрашивания позволяет достичь такой же высокой степени корреляции, как и при окрашивании клеток-основателей. Таким образом, мы рекомендуем использовать порог окрашивания в диапазоне 40%. При более низких порогах корреляция становится слабее. При более высоких порогах корреляция почти не улучшается. Вместо этого статистика становится критической, потому что большая часть GC не учитывается при анализе.

    Чтобы проиллюстрировать, как при удалении GC преобладают черные, т.е.т. е., не окрашенные, В-клетки улучшают корреляцию, которую мы строим доминирование линии по отношению к плотности цвета (рис. 3). Идеальная корреляция будет соответствовать тому, чтобы все символы были сосредоточены на диагональной линии. Символы над диагональю – это символы с низким преобладанием цвета, но с высоким преобладанием происхождения. Это можно отнести к описанным выше случаям, когда процедура окрашивания не смогла окрасить линию, которая стала доминирующей позже во время реакции GC. Эти GC преимущественно черные. Введение порога удаляет эти GC из анализа, что видно по уменьшению количества GC над диагональной линией с увеличением порога.Обратите внимание, что порог окрашивания 50% также исключает из анализа часть GC в день окрашивания (день 0, красные символы), которые по определению демонстрируют уровень окрашивания 48%. Из-за случайных колебаний все еще существует подмножество GC с уровнем окрашивания выше порога 50%. Влияние увеличения порога с 40 до 50% на более поздние моменты времени реакции GC сравнительно слабое, что объясняет незначительное изменение корреляции на рисунке 2C.

    Рисунок 3 .Более высокие пороги окрашивания исключают GC, в которых преобладают неокрашенные линии. Линейное доминирование по сравнению с произведением цветового доминирования и плотности окрашивания (PDD) с порогом окрашивания 0 (A) , 30 (B) , 40 (C) и 50% (D) . Дни GC различаются цветом символа/линии. В-клетки GC окрашивали на 2-й день после начала GC 10 цветами (таблица 1) в 1000 in silico GC.

    На графике также показано, что произведение доминирования цвета на плотность цвета имеет тенденцию к завышению доминирования родословной.Это GC с символами под диагональной линией на рисунке 3. Переоценка является результатом того, что разные персистирующие клоны окрашиваются одним и тем же цветом. Если это происходит, разные линии вносят свой вклад в один и тот же цвет, в то время как доминирование линии соответствует только одной из этих линий. Этот эффект менее выражен для больших PDD, что было подтверждено секвенированием in vivo (7). Введение порога окрашивания для выбора подмножества ГК для анализа делает более заметной долю ГК с завышенной оценкой доминирования линии.

    3.3.2. Переключение доминирующего цвета во время выбора GC

    Возможно, что неоднородное распределение цвета по В-клеткам (таблица 1) доминирует над последующей судьбой доминирования цвета. Если цвет отражает прогрессирование процесса селекции во время реакции GC, доминирующий цвет должен переключаться между моментом времени окрашивания и моментом оценки, когда отбор линий был завершен. Мы предположили, что это произойдет на 11-й день после окрашивания (21).Действительно, большая часть GC меняла доминирующий цвет между временем окрашивания и 11-м днем ​​(рис. 4). Этот результат также подтверждает, что анализ цветовых распределений является подходящей мерой для анализа отбора в GC.

    Рисунок 4 . Доминантный цвет меняется в процессе созревания GC affinity. Доминирование линии по сравнению с продуктом доминирования цвета и плотности окрашивания (PDD) с порогом окрашивания 40% на 11-й день после окрашивания (подмножество данных на рисунке 3).Черные и серые квадраты — реакции ГХ с уровнем окрашивания ниже порога, а красные и зеленые — выше порога, поэтому оставлены для анализа. Черные и красные ГК обладают тем свойством, что первоначально доминирующий цвет также доминировал на 11-й день после окрашивания. Так, в серых и зеленых ГК преобладающий цвет менялся между временем окрашивания и временем анализа. В-клетки GC окрашивали на 2-й день после начала GC 10 цветами (таблица 1) в 1000 in silico GC.

    3.3.3. Важно время окрашивания, вызванного тамоксифеном

    Время определения происхождения тамоксифеном имеет решающее значение для анализа. Для однократного окрашивания считается, что чем раньше индуцируется рекомбинация, тем лучше корреляция с доминированием линии (рис. 5А), при условии, что мы используем порог окрашивания 20% или выше. Две линии, которые выживут в долгосрочной перспективе, могут быть окрашены одним и тем же цветом, что переоценивает доминирование линии. На 3-й или 4-й день реакции GC многие В-клетки с низким сродством уже были элиминированы, так что доля долгоживущих линий увеличивается во время окрашивания.Следовательно, отнесение одного и того же цвета к разным долгоживущим линиям становится более вероятным, чем позже индуцируется окрашивание.

    Рисунок 5 . Точка времени окрашивания определяет предсказательную силу. Корреляция между линейностью и произведением цветового доминирования и плотности окраски в зависимости от времени окрашивания. Моделирование однократного окрашивания (A) или динамического затухания (B) тамоксифен-индуцированного окрашивания 10 цветами (таблица 1).Для динамического распада тамоксифена в (B) в уравнении (3) предполагалось, что период полураспада τ тамоксифена = 24 часа. Родословная определялась во время инъекции тамоксифена. Для родословных, дополненных всеми клетками-основателями, входящими в GC после инъекции, см. Рисунок S1. Для динамического распада тамоксифена с тамоксифеном, введенным на 2-й день после начала GC, распределение доминирования по клонам сравнивается с распределением продукта доминирования цвета и плотности цвета (PDD) без порога на 2-й день (C) и 13 (D ) и с порогом окрашивания 40% на 13-й день после начала GC (E) .Данные в (A, B) показывают коэффициент корреляции Пирсона для 1000 in silico GCs на 11-й день после введения тамоксифена с различными порогами окрашивания (цвета линий). 95% приблизительные доверительные интервалы для корреляции момента произведения Пирсона были рассчитаны с использованием преобразования Фишера.

    Кроме того, родословные становятся менее доминирующими, чем позже они определяются. Это связано с тем, что аналогичные варианты потенциально доминирующих линий определяются как разные линии, хотя ни одна из них не имеет преимущества в приспособленности перед другой.Следовательно, маловероятно, что один из них потеряется при дальнейшем отборе. Чем позже индуцируется окрашивание, тем более вероятно определить две сходные линии как разные линии. Как следствие, линейное доминирование становится все более и более ограниченным по мере индукции более позднего окрашивания (рис. S3). В то время как при определении линии на 1-й день после начала GC 100% доминирование линии является частым явлением, на 4-й день самое большое доминирование, обнаруженное в 1000 симуляциях GC, составляло 60%.

    3.4. Распад окрашивания клеток, индуцированного тамоксифеном

    Окрашивание, вызванное тамоксифеном, не является разовым явлением.После инъекции тамоксифена рекомбинация В-клеток может быть вызвана в течение ограниченного времени, и вероятность рекомбинации со временем снижается. Подробная динамика снижения вероятности рекомбинации неизвестна. Мы предположили экспоненциальный спад (уравнение 3), который отражает линейный спад активности тамоксифена. Поскольку нас интересует корреляция доминирования цвета с доминированием линий, существовавших во время инъекции тамоксифена, мы решили определить новую линию не во время атрибуции цвета, а во время инъекции тамоксифена.Корреляция между доминированием линии и произведением доминирования цвета и плотности цвета уменьшается в абсолютном выражении, когда такая динамика окрашивания включена (рис. 5A, B). Сравнение распределения линейного доминирования и PDD показывает, как два распределения приближаются друг к другу в ходе развития GC, но остаются отдельными, при этом значительная часть GC недооценивает линейное доминирование (Рисунки 5C, D). Это можно исправить, установив порог окрашивания 40% (рис. 5E).

    3.4.1. Набор родословных зависит от времени введения тамоксифена

    Отличие маркировки от однократного окрашивания заключается в существовании временной точки между 2 и 3 днями после появления GC, когда корреляция максимальна. Появляется популяция GC, не наблюдаемая при однократном окрашивании и характеризующаяся низким преобладанием клонов и высоким преобладанием цвета. Эта новая популяция GC существует только для раннего окрашивания (день 1 или 2 после появления GC) и устойчива к пороговым значениям окрашивания (рис. S4).Это связано с тем, что клетки-основатели вступают в реакцию GC после начала окрашивания. Действительно, если эти поздние клетки-основатели включаются в набор клонов, эта популяция ГК снова исчезает вместе с оптимальным временем окрашивания (рис. S1). При позднем окрашивании корреляция теряется из-за неоднозначности окрашивания. В ранние сроки окрашивания он теряется из-за окрашенных клеток, не принадлежащих к какой-либо контролируемой линии, что приводит к наблюдаемому оптимальному моменту времени для начала окрашивания линии В-клеток (рис. 5B).Этот результат подчеркивает, что важно сознательно выбрать момент времени инъекции тамоксифена, потому что это влияет на результирующий набор родословных и может изменить интерпретацию экспериментальных результатов.

    3.4.2. Снижение вероятности окрашивания эффективно замедляет окрашивание

    Как описано для сценария однократного окрашивания, существует общая тенденция к тому, что последующее окрашивание снижает корреляцию. При снижении окрашивающей активности, вызванной тамоксифеном, окрашивание распределяется на 2 дня, что фактически соответствует замедлению окрашивания примерно на 1 день.Действительно, инициация на 3-й день с распадом тамоксифена фактически довольно похожа на инициацию на 4-й день с однократным окрашиванием (рис. 5). Это эффективное замедление окрашивания снижает общий уровень корреляции.

    3.4.3. Влияние рекомбинации уже рекомбинированных клеток

    В течение периода активности тамоксифена клетка может подвергаться множественным рекомбинациям. Это означало бы, что клетка, уже выражающая цвет, может изменить цвет. Здесь мы исследовали, повлияет ли этот процесс на интерпретацию доминирования цвета с точки зрения доминирования линии.Когда было разрешено повторное окрашивание уже окрашенных клеток in silico , результирующая корреляция между доминированием линии и доминированием цвета еще больше снижается (рис. S5A, B). Однако было обнаружено лишь небольшое влияние на корреляцию между линейным доминированием и PDD (рис. S5C, D). В то время как возможность продолжающейся и повторяющейся рекомбинации делает результирующее преобладание цвета более нечетким, корреляция с PDD кажется надежной.

    3.4.4. Снижение вероятности окрашивания вызывает нечеткое распределение цвета

    Результирующее распределение цветов в конце процедуры окрашивания менее четко определено по сравнению с однократным окрашиванием, где распределение отражает вероятности цвета (см. Таблицу 1).При распаде тамоксифена линия, окрашенная в самом начале длительного периода окрашивания, также будет окрашивать все потомство этой линии. Напротив, для линии, окрашенной в конце периода окрашивания, окрашивается только небольшая часть потомства, поскольку клетка, определяющая линию, делилась несколько раз, и только одна из этих дочерних клеток окрашивается вместе со своим потомством. . Другое потомство той же линии может не окрашиваться или окрашиваться в другие цвета.Как следствие, доминирование цвета недооценивает доминирование линии (рисунок S3). Таким образом, в конце периода окрашивания количество окрашенных клеток из клона не обязательно отражает размер клона и увеличивает неопределенность, связанную с окрашиванием разных клонов одним и тем же цветом (переоценка) или окрашиванием одного и того же цвета. родословная с разными цветами (недооценка). Это ограничение становится еще более важным для позднего начала окрашивания, когда становится более вероятным, что две одинаковые части линии выживают при отборе GC.Более высокая изменчивость распределения цвета в конце процесса окрашивания в целом снижает корреляцию доминирования цвета и линии.

    3.4.5. Укороченная активность окрашивания тамоксифеном улучшит анализ цвета

    Некоторые из этих окрашенных GC, недооценивающих доминирование линии, удаляются порогом окрашивания (рис. 5D, E). Поскольку предполагалось, что активность тамоксифена затухает экспоненциально, во многих случаях окрашивание происходит только на одно деление после начала окрашивания, что все еще может вызывать высокую степень окрашивания.Кроме того, окрашивание другого потомства той же линии другим цветом будет поддерживать высокую фракцию окрашенных клеток. Таким образом, существует соответствующая доля GC, которая демонстрирует высокую долю окрашенных клеток выше порога окрашивания, но все же приводит к недооценке доминирования линии (рис. S4). Медленное снижение активности тамоксифена в течение нескольких дней требует более высокого порога окрашивания для анализа 50% или выше, чтобы не отставать от уровня корреляции однократных окрашиваний.Ввиду уменьшенной статистики (см. абсолютное количество GC на рисунках 5D, E) было бы более выгодно останавливать активность тамоксифена в определенные моменты времени в экспериментальных условиях. Например, можно рассмотреть возможность сокращения периода активности тамоксифена путем введения препарата уже в его активной форме в виде 4-гидрокси-тамоксифена.

    3.4.6. Позднее окрашивание ограничивает Lineage Dominance

    Чем позже определяются родословные, тем более ограничено достигнутое доминирование родословных (рис. S3).В то время как линии, полностью доминирующие в GC, существуют для окрашивания, инициированного на 1-3 день после начала GC, их частота снижается. При окрашивании на 4-й день максимальное преобладание снижается до 60%. При позднем окрашивании идентификация GCs, в которых преобладают одиночные клоны, становится редкой на основе окрашивания, индуцированного тамоксифеном.

    3.5. Цветные GC предсказывают появление черных GC

    Установление порога окрашивания в диапазоне 40% или выше оказалось критически важным для обеспечения прогностической способности доминирования цвета для доминирования линии.Это было проверено для GC, удовлетворяющих порогу окрашивания. Было бы особенно интересно, верны ли утверждения о линейном доминировании не только для сильно окрашенных GC, но и для всех GC.

    Чтобы проверить это, мы сравнили распределение доминирования клонов для GC выше и ниже порога окрашивания (рис. 6). Существует оптимальный порог окрашивания, равный 45%, при котором доминирование клонов GC, сохраненных (зеленые столбцы) и удаленных (красные столбцы) из анализа, в значительной степени идентично (рис. 6B).При более высоких порогах окрашивания (рис. 6C) доминирование линии в диапазоне 30% чаще встречается в подмножестве GC, удаленном из анализа. Таким образом, подмножество GC, оставленное для анализа, будет недооценивать доминирование линии в этом режиме. Для более низких порогов окрашивания (рис. 6А) ситуация обратная. Разница между обоими подмножествами масштабируется с отклонением порога окрашивания от 45%. Оптимальный порог окрашивания 45%, показанный на рисунке 6 для случая затухающей активности тамоксифена, в равной степени справедлив для однократного окрашивания (данные не показаны).В заключение, порог окрашивания 45% не только гарантирует достаточно хорошую корреляцию с доминированием линии с приемлемой статистикой. Это также гарантирует, что линейное доминирование, оцененное с помощью подмножества GC, окрашенных более чем на 45%, остается действительным для всего набора GC.

    Рисунок 6 . Оценка линейного доминирования GCs ниже порога окрашивания. Распределение линейного доминирования показано отдельно для GC выше (зеленый) и ниже (красный) порога окрашивания.Данные были получены из 1000 симуляций с динамическим распадом тамоксифена, как описано на рисунке 5, на 11-й день после тамоксифена. Сравнение подмножеств GC было повторено для порогов окрашивания 40 (A) , 45 (B) и 50% (C) .

    3.6. Влияние фракции окрашенных клеток

    Доля окрашенных GC В-клеток, индуцированных тамоксифеном, составляла 50% in vivo (7). Неясно, улучшит ли другая фракция окрашенных клеток корреляцию между доминированием цвета и линии или уменьшит ее.Увеличение окрашенной фракции позволило бы добиться лучшей статистики. Мы варьировали долю окрашенных клеток от 10 до 90% (рис. 7). Без введения порога окрашивания подтверждается интуитивный результат, согласно которому большее окрашивание предполагает лучшую корреляцию цвета и преобладания линии (рис. 7, красные линии).

    Рисунок 7 . Окрашивание меньшего количества клеток улучшает прогностическую способность. Корреляция между линейностью и произведением цветового преобладания и плотности окраски в зависимости от доли окрашенных клеток.Моделирование однократного окрашивания (A) или динамического распада (B) с 10 цветами (таблица 1) на 2-й день после начала GC. Коэффициент корреляции Пирсона от 1000 в silico GC на 11-й день после введения тамоксифена с различными порогами окрашивания (цвета линий). 95% приблизительные доверительные интервалы для корреляции момента произведения Пирсона были рассчитаны с использованием преобразования Фишера.

    Это соотношение изменяется для более высоких порогов окрашивания. Чем ниже окрашенная фракция В-клеток GC, тем лучше доминирование цвета информирует о доминировании клона.По сравнению с 50% окрашенными клетками с порогом окрашивания 40% такая же корреляция обнаруживается для 10% окрашенных клеток с порогом окрашивания менее 20% (рис. 7А). Существует компромисс между менее окрашенными клетками, что снижает статистику, и более низким отсечением, которое снова увеличивает статистику. Следует планировать эксперименты по окрашиванию сравнительно небольшой доли клеток, чтобы облегчить анализ и улучшить предсказательную силу цветового распределения. Окрашивание более низких фракций клеток требует менее повторяющихся доз тамоксифена, так что ограничения, связанные с длительными периодами окрашивания (рис. 5), также уменьшаются.

    Та же тенденция сохраняется и для активности тамоксифена в течение 2 дней. Однако общий уровень корреляции ниже (рис. 7В).

    Тамоксифен-индуцированное окрашивание клеток индуцирует распределение цвета, которое несет информацию о распределении клонов, но не о клонах. Информация о клетках-основателях сильно утеряна. В пределе фракций с низким окрашиванием и высокими порогами окрашивания можно получить достоверную корреляцию раннего доминирования цвета, индуцированного одним выстрелом, и клонального доминирования (рис. S6).Однако уже на 2-й день корреляция становится довольно слабой.

    3.7. Предсказательная сила 4 и 10 цветов одинакова

    В экспериментальных условиях разнообразие цветов создается с использованием так называемого аллеля мозговой дуги (1), который был реализован у мышей Rosa26 Confetti (5). Случайная Cre-рекомбинация цветных сегментов индуцируется инъекцией тамоксифена и генерирует клетки с 4 разными цветами. Когда окрашивание мозговой луковицы применяется к обоим аллелям, разнообразие цветов увеличивается до 10 цветов (7).Здесь мы исследовали, являются ли 10 цветов более предсказуемыми для доминирования линии у GCs, чем у мышей Confetti с одним аллелем. Оказывается, корреляция доминирования линии и произведения доминирования цвета и окрашенной доли клеток довольно сходна с 4 или 10 цветами (сравните рисунок 8 с рисунками 5A, B и рисунок 7). В частности, при однократном окрашивании обнаружено, что прогностическая способность 4 цветов даже лучше, чем 10 цветов, для раннего окрашивания и малых фракций окрашенных клеток (рис. 8А, С).Кроме того, для моделирования с затухающей активностью тамоксифена оптимальный момент времени (3-й день после начала GC) для начала окрашивания такой же, как для 10 цветов, и общая корреляция снижается до аналогичной степени (рис. 8B). Этого можно избежать, уменьшив долю изначально окрашенных клеток (рис. 8D).

    Рисунок 8 . Четыре цвета имеют аналогичную предсказательную силу, чем 10 цветов. Корреляция между родословной и произведением цветового преобладания и плотности в зависимости от момента времени окрашивания (A,B) или доли окрашенных клеток (C,D) .Моделирование с одиночным выстрелом (A, C) или динамическим затуханием (B, D) окрашивания, вызванного тамоксифеном, с 4 цветами (таблица 1) (сплошные линии) или с 10 цветами с равной вероятностью (пунктирные линии). Для динамического распада тамоксифена в уравнении (3) предполагалось, что период полураспада τ тамоксифена = 24 часа. Происхождение определяли по клеткам, присутствующим во время инъекции тамоксифена. Коэффициент корреляции Пирсона от 1000 в silico GC на 11-й день после введения тамоксифена с различными порогами окрашивания (цвета линий).95% приблизительные доверительные интервалы для корреляции момента произведения Пирсона были рассчитаны с использованием преобразования Фишера.

    Неожиданный результат, заключающийся в том, что 10 цветов не будут значительно лучшими предикторами, чем 4 цвета, побудил нас проверить, не будет ли причина отсутствия улучшения при большем количестве цветов связана с довольно неоднородной вероятностью активации различных цветов (таблица 1). Действительно, при допущении равных вероятностей для всех 10 цветов прогностическая способность лучше, чем для 4 цветов, а также лучше, чем для 10 цветов, исходя из реальных вероятностей активации в таблице 1 (сравните рис. 8B, пунктирные и сплошные линии).

    4. Обсуждение

    Настоящий анализ подтверждает, что конструкция Brainbow подходит для анализа эволюционной системы, такой как эволюция GC B-клеток в контексте иммунного ответа. Когда все В-клетки зародышевой линии окрашиваются перед реакцией GC, распределение окраски во время и в конце эволюционного процесса в реакции GC предсказывает клональное распределение. Таким образом, окрашивание и отслеживание судьбы цветов является хорошим приближением для анализа клональной эволюции.Секвенирование В-клеток необходимо только для учета конкретных клонов, но клональное доминирование хорошо оценивается только по цветам.

    Когда Cre-зависимая рекомбинация используется для окрашивания В-клеток в ходе реакции GC, цвет предсказывает клональный состав при условии, что окрашивание ограничено довольно коротким временным интервалом. Чем дольше продолжается окрашивание, тем слабее корреляция с клональным распределением. При длительной процедуре окрашивания неоднозначность окрашивания, например окрашивание двух линий одним и тем же цветом, усугубляется изменчивостью начальных состояний цветовых распределений.Линия определяется в начале процедуры окрашивания, так что событие позднего окрашивания приводит к небольшому количеству окрашенных клеток по сравнению с событием раннего окрашивания, когда окрашивается вся ветвь линии. По этой причине рекомендуется ограничить действие тамоксифена коротким периодом времени.

    Важным источником неоднозначности является то, что существует только часть клеток, окрашенных рекомбинацией, индуцированной тамоксифеном. Это означает, что существует доля GC, в которой неокрашенные В-клетки станут доминирующими.Хорошая предсказательная сила зависит от устранения GC с преобладанием черного, что может быть достигнуто путем введения порога окрашивания. Этот порог исключает из анализа все плохо окрашенные GC. Подходящий порог окрашивания находится в диапазоне 40%. При более длительном периоде окрашивания 50% приводит к лучшим результатам. Был определен порог окрашивания, равный 45%, что позволяет экстраполировать линейное доминирование, полученное из подмножества GC выше порога окрашивания, на весь набор измеренных GC, включая GC, не включенные в анализ.

    Интуитивно можно было бы ожидать, что окрашивание большего количества В-клеток улучшит предсказательную силу. Это верно только без порога окрашивания, таким образом, включая все GC, независимо от того, насколько сильно они окрашены. Однако вместе с введением порога окрашивания соотношение становится обратным. Низкоокрашенные фракции значительно более предсказуемы для клонального доминирования, чем высокоокрашенные фракции. В то же время общее количество ГК, элиминируемых порогом, увеличивается, если окрашивается лишь небольшая доля В-клеток на ГК.Таким образом, в будущем дизайне таких экспериментов важно найти правильный баланс между статистической значимостью и низким уровнем окрашивания. Окрашивание 30% В-клеток GC кажется хорошей отправной точкой с точки зрения in silico GCs.

    Важным параметром является время окрашивания. Общая тенденция – чем раньше, тем лучше. В более поздние моменты времени окрашивается предварительно выбранный набор В-клеток, что увеличивает ошибки окрашивания разных линий одним и тем же цветом, таким образом, еще больше переоценивая клональное доминирование по цветовому доминированию.Это происходит потому, что предварительно отобранные В-клетки с большей вероятностью выживут и сохранятся в продолжении реакции GC. Однако в очень ранние моменты времени набор различных родословных ограничен. С физиологической точки зрения может иметь смысл подождать, пока не будет достигнуто минимальное разнообразие В-клеток. В противном случае было бы более целесообразно использовать систему Mx1-Cre, в которой В-клетки-основатели GC уже несут цвет, когда они начинают реакцию GC.

    В зависимости от рассматриваемого вопроса может потребоваться проанализировать набор клеток, присутствующих в GC в конкретный момент времени, когда индуцируется окрашивание, или всех клеток, окрашивающихся в ходе реакции GC.В последнем случае более раннее окрашивание увеличивает прогностическую силу. В первом случае более раннее окрашивание снижает предсказательную силу. Это происходит из-за поздних клеток-основателей, которые вступают в реакцию in silico GC и все еще окрашиваются. Окрашенные В-клетки существуют без какого-либо аналога в анализе. Если в центре внимания исследования находятся линии, определенные в определенный момент времени, существует временная точка индукции окрашивания между 2 и 3 днями после начала GC, которая является оптимальной для анализа доминирования линий.

    Анализ основан на наборе 1000 симуляций GC in silico в соответствии с данными двухфотонной визуализации (22–24) и экспериментов против DEC205-OVA (15). Этот набор симуляций ГХ использовался для интерпретации данных Tas et al. (7) и хорошо коррелирует с его результатами. Клональное и цветовое доминирование, вероятно, зависит от параметров модели, таких как сродство клеток-основателей к антигену, скорость деления, давление отбора, сила обратной связи с антителами и т. д. Другой набор симуляций вполне может количественно изменить тот или иной результат при условии изменения будет влиять на время отбора или количество мутаций в реакции GC.Например, качество клеток-основателей GC может варьироваться в зависимости от типа иммунизации и наличия трансгенных В-клеток с определенной аффинностью к иммунизирующему антигену. Это означает, что планирование новых экспериментов в идеале должно идти рука об руку со специально адаптированным набором симуляций.

    Вклад авторов

    MM-H и GV инициировали исследование. MM-H разработал код C++ и провел анализ. SB внес свой вклад в R-кодирование и стратегию анализа данных.ММ-Х написал рукопись. Все авторы внесли свой вклад в научное содержание и интерпретацию и отредактировали рукопись.

    Финансирование

    MM-H был поддержан Human Frontier Science Program (RGP0033/2015). Его также поддержали Инициатива Гельмгольца по персонализированной медицине – iMed и Ассоциация Гельмгольца, Zukunftsthemen, старение и метаболическое программирование (AMPro), а также иммунология и воспаление (ZT-0027). SB был поддержан Федеральным министерством образования и исследований Германии в рамках мер по созданию системной медицины, проект SYSIMIT (проект BMBF eMed SYSIMIT, FKZ: 01ZX1308B).SB и MM-H были поддержаны пилотным проектом «Информация и наука о данных» Ассоциации Гельмгольца, проект «Модели пониженной сложности».

    Заявление о конфликте интересов

    Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

    Дополнительный материал

    Дополнительный материал к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2018.02020/full#supplementary-material

    Код для анализа

    https://figshare.com/articles/Computer_Simulation_of_MultiColor_Brainbow_Staining_and_Clonal_Evolution_of_B_Cells_in_Germinal_Centers/7068419

    Каталожные номера

    1. Livet J, Weissman T, Kang H, Draft R, Lu J, Bennis R, et al. Трансгенные стратегии комбинаторной экспрессии флуоресцентных белков в нервной системе. Природа (2007) 450:56–62.doi: 10.1038/nature06293

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    2. Singh S, LaSarge C, An A, McAuliffe J, Danzer S. Клональный анализ пролиферации и развития гранулярных клеток гиппокампа новорожденных при эпилепсии височной доли. eNeuro (2015) 2:e0087–15. doi: 10.1523/ЕНЕВРО.0087-15.2015

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    3. Ван Дж., О’Салливан М., Мукерджи Д., Пунал В., Фарсиу С., Кей Дж. Анатомия и пространственная организация глии Мюллера в сетчатке мыши. J Комп Нейрол. (2017) 525:1759–77. doi: 10.1002/cne.24153

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    5. Snippert H, van der Flier L, Sato T, van Es J, van den Born M, Kroon-Veenboer C, et al. Гомеостаз кишечных крипт является результатом нейтральной конкуренции между симметрично делящимися стволовыми клетками Lgr5. Cell (2010) 143:134–44. doi: 10.1016/j.cell.2010.09.016

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    6.Хеннингер Дж., Сантосо Б., Ханс С., Дюран Э., Мур Дж., Мосиманн С. и др. Картирование судеб клонов количественно определяет количество гемопоэтических стволовых клеток, возникающих во время развития. Nat Cell Biol. (2017) 19:17–27. дои: 10.1038/ncb3444

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    7. Tas J, Mesin L, Pasqual G, Targ S, Jacobsen J, Mano Y, et al. Визуализация созревания аффинности антител в центрах зародыша. Наука (2016) 351:1048–54. дои: 10.1126/наука.aad3439

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    9. Victora G, Dominguez-Sola D, Holmes A, Deroubaix S, Dalla-Favera R, Nussenzweig M. Идентификация клеток светлой и темной зоны зародышевого центра человека и их связь с B-клеточными лимфомами человека. Кровь (2012) 120:2240–8. doi: 10.1182/blood-2012-03-415380

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    12. Купперс Р., Чжао М., Хансманн М.Л., Раевский К.Отслеживание развития В-клеток в зародышевых центрах человека с помощью молекулярного анализа отдельных клеток, взятых из гистологических срезов. EMBO J. (1993) 12:4955–67.

    Академия Google

    13. Амитай А., Месин Л., Виктора Г., Кардар М., Чакраборти А. Модель динамики популяции для клонального разнообразия в зародышевом центре. Фронт микробиол. (2017) 8:1693. doi: 10.3389/fmicb.2017.01693

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    15.Виктора Г.Д., Швикерт Т.А., Фуксман Д.Р., Камфорст А.О., Мейер-Херманн М., Дастин М.Л. и соавт. Динамика зародышевого центра, выявленная с помощью многофотонной микроскопии с фотоактивируемым флуоресцентным репортером. Cell (2010) 143:592–605. doi: 10.1016/j.cell.2010.10.032

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    16. Мейер-Херманн М., Мор Э., Пеллетье Н., Чжан Ю., Виктора Г.Д., Тёлльнер К.М. Теория отбора, деления и выхода В-клеток зародышевого центра. Представитель сотовой связи (2012) 2:162–74. doi: 10.1016/j.celrep.2012.05.010

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    20. Биндер С., Мейер-Херманн М. Влияние прижизненной визуализации зародышевых центров мышей на контроль селекции и деления В-клеток. Фронт Иммунол. (2016) 7:593. doi: 10.3389/fimmu.2016.00593

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    21. Jacob J, Przylepa J, Miller C, Kelsoe G. Исследования in situ первичной реакции на (4-гидрокси-3-нитрофенил)ацетил.III. Кинетика мутации и селекции V-области в В-клетках зародышевого центра. J Exp Med. (1993) 178:1293–307. doi: 10.1084/jem.178.4.1293

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    23. Schwickert TA, Lindquist RL, Schakhar G, Livshits G, Skokos D, Kosco-Vilbois MH, et al. Визуализация зародышевых центров in vivo показывает динамическую открытую структуру. Природа (2007) 446:83–7. doi: 10.1038/nature05573

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    24.Хаузер А.Е., Юнт Т., Мемпель Т.Р., Снеддон М.В., Кейнштайн С.Х., Хенриксон С.Е. и др. Определение миграции В-клеток зародышевого центра in vivo выявляет преобладающие модели интразональной циркуляции. Иммунитет (2007) 26:655–67. doi: 10.1016/j.immuni.2007.04.008

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Сегментация патологических изображений менингиомы, окрашенных HE, на основе псевдометок

    Abstract

    Биомедицинские исследования неотделимы от анализа различных гистопатологических изображений, и изображения, окрашенные гематоксилин-эозином (ГЭ), являются одним из самых основных и широко используемых видов.Однако в настоящее время подходы к анализу изображений такого типа, основанные на машинном обучении, в значительной степени зависят от ручной маркировки изображений для обучения. Полностью автоматизированная обработка окрашенных HE изображений остается сложной задачей из-за высокой степени неопределенности интенсивности цвета, размера и формы окрашенных клеток. Для этой задачи мы предлагаем полностью автоматический метод попиксельной семантической сегментации, основанный на псевдометках, который позволяет значительно сократить работу по рисованию и маркировке ячеек вручную перед машинным обучением и гарантирует точность сегментации.Во-первых, мы собираем надежные обучающие выборки без учителя на основе результатов кластеризации K-средних; во-вторых, мы используем стратегию полного смешения для улучшения обучающих изображений и получения модели U-Net для сегментации ядер по фону. Экспериментальные результаты, основанные на наборе данных изображений патологии менингиомы, показывают, что предложенный метод имеет хорошую производительность, а патологические признаки, полученные статистически на основе результатов сегментации, могут быть использованы для помощи в клинической оценке менингиом.По сравнению с другими стратегиями машинного обучения он может более эффективно служить надежной ссылкой для клинических исследований.

    Образец цитирования: Wu C, Zhong J, Lin L, Chen Y, Xue Y, Shi P (2022) Сегментация патологических изображений менингиомы, окрашенных HE, на основе псевдометок. ПЛОС ОДИН 17(2): е0263006. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0263006

    Редактор: Чжифань Гао, Университет Сунь Ятсена, КИТАЙ

    Получено: 9 июля 2021 г .; Принято: 10 января 2022 г .; Опубликовано: 4 февраля 2022 г.

    Авторское право: © 2022 Wu et al.Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

    Доступность данных: В настоящее время данные не могут быть опубликованы из-за соглашения об этике, и они будут опубликованы в будущем. Данные доступны в объединенной больнице Медицинского университета Фуцзянь (контакт через http://www.fjxiehe.com/) для исследователей, отвечающих критериям доступа к конфиденциальным данным.Мы также загрузили минимальный базовый набор данных и соответствующую спецификацию в качестве вспомогательных информационных файлов, включая все исходные изображения, которые были обработаны и показаны на рисунках в статье. Наша исследовательская группа также создает полный набор тестовых данных, используемых в экспериментах статьи, которая находится на рассмотрении местного комитета по этике. Набор данных будет загружен онлайн для общего доступа после одобрения заявки. Прежде чем размещать весь набор данных в Интернете, все читатели могут напрямую запросить исходные изображения, связавшись с соответствующим автором.

    Финансирование: Эта работа была поддержана Совместным фондом инноваций в области науки и технологий провинции Фуцзянь (2018Y9112) и Проектом обучения талантов в области научных исследований в области здравоохранения провинции Фуцзянь (2019-ZQN-17). Спонсоры не участвовали в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

    Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

    Введение

    В последние годы заболеваемость опухолями и смертность населения во всем мире быстро растут [1].Раннее выявление и точная диагностика могут сделать лечение более эффективным и тем самым повысить шансы на выживание, а анализ гистопатологических изображений опухоли является золотым стандартом диагностики опухолей [2]. Окрашивание гематоксилин-эозином (ГЭ) является одним из наиболее часто используемых методов наблюдения патологических парафиновых срезов, особенно при анализе микроскопических гистопатологических изображений опухолевой ткани [3], при котором ядро ​​окрашивается гиацинтином щелочным гематоксилином, а цитоплазма окрашивается кислым эозином в красный цвет.Таким образом, различия между различными клеточными структурами в ткани эффективно увеличиваются. На гистопатологических изображениях, окрашенных HE, морфология ядра является основой для суждения о природе рака. Например, размер, форма и плотность ядра влияют на качественный анализ опухоли. Однако патологоанатомам сложно анализировать большие объемы данных, окрашенных HE, а результаты анализа подвержены субъективным факторам [4].

    Исследователи ищут прорывы в сегментации ядер на патологических изображениях, потому что обнаружение и сегментация ядер являются самыми основными и важными этапами в процессе анализа патологических изображений.Большинство морфологических методов основано на пороговом алгоритме, алгоритме водораздела, наборе статистических уровней, модели активного контура или комбинации этих подходов [5–9]. Эти методы обеспечивают отличные результаты сегментации при определенных условиях. Однако при анализе фактического патологического изображения тканей, окрашенных HE, при использовании вышеуказанных методов могут возникнуть следующие проблемы. Во-первых, поскольку на окрашивание HE сильно влияют внешние факторы, существует большая изменчивость в окрашивании ядер.Во-вторых, отсутствие четкой ядерной границы делает эти методы чрезвычайно склонными к чрезмерной сегментации. В-третьих, разнообразие форм ядер затрудняет создание модели стабильной формы.

    В связи с быстрым развитием машинного обучения сегментация изображения упрощается за счет маркировки всех пикселей изображения посредством обучения, которое состоит из двух основных категорий: 1) классические методы сегментации машинного обучения: сегментация пикселей основана на наборах признаков, извлеченных на основе хорошо разработанные модели и введенные в классические методы машинного обучения для присвоения определенной категории каждому пикселю всего изображения.2) Методы глубокого обучения для сегментации изображения: различные типичные фрагменты изображения вручную выбираются в качестве обучающего набора данных и вводятся в модель нейронной сети для сегментации различных частей клетки, таких как ядро, цитоплазма и внеклеточное пространство (ECS), затем обученная сеть используется для сегментации всех других немаркированных изображений.

    В качестве классических подходов к машинному обучению Mittal et al. [10] использовали метод суперпиксельной кластеризации для сегментации ядер клеток и использовали алгоритм гравитационного поиска для оптимизации центров кластеров.Ку и др. [11] предложили метод, основанный на попиксельном классификаторе машины опорных векторов (SVM) для сегментации опухолевых гнезд и стромы. Между тем в последнее время были сделаны прорывы в анализе естественных и патологических изображений с помощью глубокого обучения, появились различные методы ядерной сегментации, основанные на глубоком обучении. В задачах сегментации первоначально сверточные нейронные сети (CNN) использовались только для выделения признаков, а с появлением полностью сверточных сетей (FCN) [12] семантическая сегментация постепенно стала основным методом сегментации, и появились различные улучшенные модели. .Чен и др. [13] представили новую глубокую сеть с учетом контуров (DCAN) и использовали многоуровневую контекстную FCN для сквозного создания многомасштабных представлений признаков. Путем модификации модели FCN Qu et al. [14] получили сверточную нейронную сеть с полным разрешением (FullNet) для сохранения более подробной информации. U-Net Ronneberger et al. [15] привнесли новую жизненную силу в модель сегментации патологических изображений, и было создано множество оптимизированных версий. Пан и др.[16] расширенная U-Net с жесткой разделяемой по глубине сверткой (AS-UNet) для ядерной сегментации. В исследовании [17] была предложена нейронная сеть на основе U-Net с вниманием к остаточному каналу (RIC-UNet), в которой применялись остаточные блоки, а также механизмы мультимасштабирования и внимания к каналу для повышения точности сегментации.

    Все вышеперечисленные методы являются улучшениями с точки зрения модельных аспектов, но одна из существенных проблем глубоких нейронных сетей все еще неразрешима: необходимость большого количества размеченных вручную точек данных, что особенно важно при анализе медицинских изображений.Поскольку существует высокая потребность в специалистах по аннотации медицинских изображений, для дальнейшего повышения эффективности машинного обучения при подготовке набора данных для обучения. В связи с этим мы предлагаем полностью автоматический метод ядерной сегментации патологического изображения на основе псевдометки, как показано на рис. как к установленным правилам, так и к результатам кластеризации. Во-вторых, разрабатывается новый алгоритм обучения, который не имеет фиксированной эпохи, и полученные фрагменты обучающей выборки помещаются в модель для обучения с операцией полного смешения в соответствии с вероятностью.Затем перекрывающиеся участки тестовых изображений нарезаются до одинакового размера и доставляются в модель для получения результатов прогнозирования, а результаты сегментации переднего плана ядер получаются путем сшивания. Наконец, алгоритм гибридного водораздела используется для сегментации границ между ядрами, получения окончательного результата сегментации и подсчета соответствующих патологических признаков. По сравнению как с традиционными методами машинного обучения, так и с методами глубокого обучения, использование неконтролируемой кластеризации заменяет утомительный процесс ручного аннотирования обучающих наборов, а стратегия полного смешивания используется для решения проблемы плохой способности к обобщению автоматически полученных наборов обучающих патчей. .

    Материалы и методы

    В этом разделе мы в основном сосредоточимся на подробном процессе обучения образцов и их псевдометок, которые могут автоматически получать надежные участки из полных изображений, окрашенных HE. Для решения задачи обобщения предлагается серия протоколов обучения и тестирования.

    Получение изображений, окрашенных HE, и ядерной аннотации

    В данной работе в качестве объектов эксперимента мы использовали патологические изображения менингиомы. Всемирная организация здравоохранения классифицирует менингиомы на три степени: доброкачественные менингиомы (ВОЗ I), атипичные менингиомы (ВОЗ II) и интерстициальные или злокачественные менингиомы (ВОЗ III).Первая степень известна как низкосортная, а вторая и третья классифицируются как менингиомы высокой степени злокачественности [18]. Таким образом, существуют определенные различия между менингиомами высокой и низкой степени злокачественности, которые очень подходят для проверки обобщающей способности предлагаемого метода.

    Подготовка набора данных была выполнена на образцах тканей двух групп, включая менингиомы высокой и низкой степени злокачественности, от различных клинических пациентов в больнице Союза медицинского университета Фуцзянь. Местный комитет по этике предоставил этическое одобрение для исследования (Сертификат №2019KJTYL024), и было получено информированное согласие. Микроскопические срезы окрашивали HE с помощью стандартной гистологической процедуры, описанной в [19], а затем изображения RGB были захвачены и сохранены в виде 1536 × 2048 × 24-битных tiff-файлов. В итоге мы получили в общей сложности 60 окрашенных HE срезов тканей менингиом высокой и низкой степени злокачественности, в том числе 30 менингиом высокой степени злокачественности и 30 менингиом низкой степени злокачественности. Изображения пяти наиболее репрезентативных областей, определенных профессионалами в каждом срезе, были собраны для формирования наборов изображений HE.Таким образом, всего в работе было использовано 300 (60 групп × 5) изображений, окрашенных HE.

    Чтобы включить как можно более разнообразные проявления ядер, мы случайным образом выбрали 20 изображений разных групп из собранных 60 групп, включая 300 окрашенных HE патологических изображений, полученных из образцов менингиомы как высокой, так и низкой степени злокачественности. Выбранный набор данных включал 10 изображений менингиомы высокой степени злокачественности и 10 изображений менингиомы низкой степени злокачественности. Патологическое изображение размером 1536 × 2048, окрашенное HE, содержит около 800 ядер, которые необходимо аннотировать, поэтому на 20 изображениях содержится около 16 000 ядер.Мы использовали программное обеспечение MaZda4.6 [20] для аннотирования этих ядер, а аннотаторами были два врача из Union Hospital Медицинского университета Фуцзянь.

    Процесс выбора обучающей выборки на основе обучения без учителя

    В этом разделе представлен метод неконтролируемого отбора обучающих образцов, который автоматически выбирает наиболее надежные участки, включая ядра и их метки, на основе характеристик окрашивания каждого среза. Эти образцы затем используются для обучения модели глубокого обучения для сегментации ядер других изображений, окрашенных HE.

    Выбор функции.

    Существует два вида проблем с качеством изображений, окрашенных HE: неравномерное распределение красителей в тканях и шум соли и перца, вызванный мелкими частицами красителя. В соответствии с этими задачами изображение фильтруется комбинацией медианного фильтра 5×5 [21] и фильтра Гаусса 5×5 [22] для устранения шумов. Более ранние исследования нашей группы доказали, что выбранные наборы признаков эффективны для сегментации ядер [23]. Двухцветные каналы R и G предоставляют гораздо больше информации для результата классификации, чем цветовой канал B.Следовательно, чтобы снизить вычислительные затраты и повысить эффективность предлагаемого конвейера, выбираются интенсивности цветовых каналов R и G и сопоставляются с двумерным пространством признаков для формирования набора двумерных признаков.

    Приобретение стабильной окраски участков ядер.

    Манхэттенская кластеризация K-средних на основе расстояния применяется для автоматического получения ядерно-стабильных цветовых областей. На изображениях, окрашенных HE, есть три различных клеточных структуры, а именно: ядерная область, цитоплазматическая область и ECS.Четкой границы между вышеперечисленными структурами на изображениях, окрашенных HE, нет. Чтобы получить более надежные области ядер для построения обучающей выборки, мы сначала устанавливаем классы кластеризации равными пяти и случайным образом инициализируем центры кластеризации. Поскольку модули собственных векторов ядер, цитоплазмы и наборов признаков ECS на практике возрастают, средние значения всех центров кластеризации также следуют этому порядку. Затем в результате кластеризации получают следующие пять категорий на уровне пикселей: область стабильного ядерного цвета, область ядерно-цитоплазматической нечеткости, область стабильного цитоплазматического цвета, область нечеткой цитоплазматической ЭКС и область стабильного цвета ЭКС.

    Только Точность необходимо учитывать при группировании ядерных областей для автоматического выбора ядерных пятен, а увеличение Отзыва может дать больше возможностей для выбора подходящих обучающих образцов. Мы извлекаем несколько репрезентативных изображений, окрашенных HE, и сравниваем ядерные области, полученные путем кластеризации, с искусственно нарисованными ядерными областями. На рис. 2 показано распределение пикселей стабильного цвета ядер на разных изображениях. Оливковые области — это глубоко окрашенные участки стабильных цветных областей ядер, полученных путем кластеризации, которые можно использовать в качестве областей-кандидатов для обучающих выборок.

    Рис. 2. Сравнение реальных результатов и результатов кластеризации ядер.

    Где оливковые области обозначают стабильные цветовые области ядер в результате кластеризации, а зеленые контуры указывают основные истины ядерной стабильной цветовой области.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0263006.g002

    Коллекция обучающих наборов изображений.

    Поскольку наша задача состоит в том, чтобы сегментировать целые области ядер, мы дополнительно объединяем пять вышеуказанных категорий, полученных путем кластеризации.Во-первых, пиксели, принадлежащие областям стабильного цвета ядер, могут использоваться в качестве переднего плана обучающих выборок, поэтому никаких изменений не производится. Во-вторых, пиксели, принадлежащие к ядерно-цитоплазматическим нечетким областям, включают как ядерные, так и цитоплазматические пиксели, поэтому они определяются как нечеткие области. Наконец, пиксели, принадлежащие к областям стабильного цвета цитоплазмы, нечетким областям цитоплазмы-ECS и областям стабильного цвета ECS, объединяются в одну категорию, которая определяется как неядерная область. Подробные результаты интегрирования представлены в таблице 1.

    Автоматическая коллекция исправлений показана в виде псевдоцветных изображений различных категорий на рис. 3. Наборы обучающих изображений строятся на основе следующих правил скрининга. Мы проектируем окно размером 48 × 48 пикселей и устанавливаем размер шага 8 пикселей, чтобы скользить по всему псевдоцветному изображению метки категории. Когда в окне находится более 100 пикселей области ядерно-стабильного цвета и доля пикселей в нечеткой области меньше α , исходное изображение HE с окном захватывается в качестве фрагмента обучающего изображения, а соответствующая позиция в псевдоцветном изображении метки категории фиксируется как метка патча обучающего изображения.Поскольку нечеткие области в основном находятся вокруг ядерной стабильной цветовой области, трудно полностью избежать нечетких областей. Чтобы свести к минимуму влияние нечетких областей на эффект обучения, мы установили здесь α равным 0,05. Результат показан на патче обучающего изображения и патче обучающей метки на рис. 3.

    Рис. 3. Процесс сбора патчей обучающего изображения.

    Где белые области на изображении метки категории представляют собой цветные области ядерной стабильности, серые области — нечеткие области, черные области — неядерные области, а зеленые прямоугольники обозначают области, выбранные для обучения.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0263006.g003

    Протоколы обучения и тестирования

    Как показано на рис. 2, поскольку ядра, которые могут быть захвачены без присмотра, являются ядрами на каждом изображении и в основном не превышают аннотированное вручную положение контура зеленых линий, которое показывает, что наиболее глубоко окрашенные части, обучающие наборы, собранные автоматический сбор непосредственно используется для обучения модели, что может привести к недостаточной сегментации ядер при легком окрашивании.Обычно бывает трудно различить некоторые светло-голубые ядра с окружающей их цитоплазмой. Таким образом, точная сегментация слегка окрашенного ядра является ключевой задачей ядерной сегментации. Мы разрабатываем серию протоколов обучения и тестирования для обучающих наборов, чтобы улучшить обобщающую способность предлагаемой модели, чтобы максимизировать разрешение слабо окрашенных ядер.

    Модель сверточной нейронной сети.

    Мы используем модель сети U-Net [15], которая является одной из наиболее широко используемых сетей для сегментации изображений, для проверки предложенного метода построения псевдометки.Модель U-Net является усовершенствованием и расширением FCN, в котором используются слои свертки и слои пула для извлечения признаков, а затем используются слои деконволюции для восстановления размера изображения. Модель представляет собой зрелую базовую модель семантической сегментации, и ее эффективность была полностью проверена. Простая структура U-net может свести к минимуму влияние самой модели сегментации и более точно проверить предлагаемый метод псевдометки.

    Наборы для обучения и тестирования.

    Мы используем 20 вручную аннотированных изображений в качестве тестовых наборов модели.Учитывая, что пять изображений одной и той же группы, полученные от одного пациента в одно и то же время, морфология ядер и окрашивание были очень похожими. Поэтому для обеспечения разумности и надежности точности теста изображения, используемые в качестве тестовых наборов, и другие изображения в той же группе не участвуют в производстве обучающих наборов. С помощью разработанного неконтролируемого метода поиска достоверной обучающей выборки из оставшихся 40 групп по 200 изображений получают более 200 000 патчей размером 48×48, которые можно использовать для обучения.Мы распределяем обучающие наборы и проверочные наборы в соответствии с соотношением 4 к 1, поэтому обучающие наборы обычно содержат более 160 000 исправлений, а проверочные наборы содержат более 40 000 исправлений.

    Полный набор тренировочных патчей.

    Поскольку созданные нами обучающие наборы состоят из наиболее хорошо окрашенных ядер на различных изображениях, окрашенных HE, сеть, обученная с помощью исходных обучающих наборов, не может сегментировать слабо окрашенные ядра, что приводит к отсутствию способности к обобщению.Для компенсации этой проблемы применяется стратегия полного смешивания обучающих выборок. Мы используем следующие методы для выполнения операции микширования: (1) (2) Куда I x и I y – это разные входные процедуры. x и y y – это разные входные этикетки. Как показывают уравнения (1) и (2), операция полного смешения объединяет разные изображения с λ в качестве веса и напрямую накладывает метки изображений.Поскольку каждое изображение, окрашенное HE, является реальным и эффективным, они имеют одинаковую важность, поэтому мы устанавливаем вес смешивания λ равным 0,5. Операция «ИЛИ» выполняется между двоичными метками L x и L y в уравнении (2).

    Как показано на рис. 4, по сравнению с исходным изображением, на смешанном изображении имеется гораздо больше слабо окрашенных ядер, что вызвано смешением ядерных областей одного изображения с цитоплазматическими областями или областями ЭКС другого изображения.Ядра, созданные при смешивании изображений, очень похожи на слегка окрашенные ядра на исходном изображении, поэтому эта операция устраняет проблему, связанную с тем, что при обучении с самоконтролем можно было выбрать только наиболее окрашенные области ядер. На практике мы определяем, нужно ли полностью перемешивать группу обучающих наборов размером с пакет во входной сети, в соответствии с вероятностью P . При необходимости этот набор обучающих наборов случайным образом чередуется и полностью перемешивается внутри группы, а P является переменным в процессе обучения.

    Функция потери.

    Обучающий эффект изображения обучающей выборки после полного смешения является ключом к тому, может ли модель различать слабо окрашенные ядерные пиксели. Чтобы увеличить интенсивность штрафа за ядерные пиксели в смешанном изображении, мы используем взвешенную бинарную функцию кросс-энтропийных потерь, и уравнение выглядит следующим образом: (3) среди них, (4) где N — размер партии, y n — истинное значение ядерного изображения, а x n — прогнозируемое значение (от 0 до 1).Для веса w n , который инициализируется как матрица со всеми элементами 1, мы накладываем удвоенный вес на ядерные пиксели в пакете, если выполняется полное смешение, но для фона и пакета без операции полного смешивания мы сохраняем первоначальный вес.

    Критерий оценки.

    Критерии, включая точность (ACC), прецизионность (PC), отзыв (RC), специфичность (SP) и показатель F1 (F1), широко используются для оценки эффективности ядерной сегментации на патологических изображениях, а расчетные уравнения для них параметры показаны в уравнениях (5)–(9).(5) (6) (7) (8) (9)

    Точность (ACC) представляет собой отношение правильно сегментированных ядерных и фоновых пикселей к общему количеству пикселей в изображении. При сравнении результатов сегментации (SR) с наземной истиной (GT) точность (PC) представляет собой долю правильно сегментированных ядерных пикселей в SR к общему количеству ядерных пикселей в SR. Отзыв (RC) можно также назвать чувствительностью, которая относится к специфичности (SP). Первый указывает на отношение правильных ядерных пикселей в SR к ядерным пикселям в GT, а второй указывает на отношение правильных неядерных пикселей в SR к неядерным пикселям в GT.Значение F1-score(F1) является гармоническим средним значением точности и полноты, а TP, FP, FN и TN представляют истинно положительный, ложноположительный, ложноотрицательный и истинно отрицательный результат соответственно. Кроме того, мы вводим два других показателя из [24], сходство Жаккара (JS) и коэффициент Дайса (DC), а уравнения для их расчета показаны в уравнениях (10) и (11). (10) (11) Из уравнений (10) и (11) мы можем видеть, что JS и DC оба описывают совпадение SR и GT; эти параметры часто используются для расчета подобия или перекрытия SR и GT.При полном совпадении SR и GT значения JS и DC равны 1.

    Динамическая стратегия обучения.

    Во время обучения модели, в отличие от обычно используемых фиксированных значений эпох, мы используем значение вероятности P в операции полного смешивания для определения эпохи обучения. Псевдокод динамического процесса описывается как Алгоритм 1:

    .

    Алгоритм 1 Стратегия обучения

    Вход : индикаторы JS и DC в точности обучения и точности проверки каждой эпохи;

    Вывод : Вес лучших моделей U-Net;

    1: Установите и инициализируйте параметры: Лучший _ оценка ← 0; Р ← 0.1;

    2: для каждой эпохи до

    3:  ; ;

    4:   , если ScoreV > Лучший _ оценка − 0,005 и | ScoreT ScoreV | < 0,06 затем

    5:   Сохранить текущие веса модели;

    6:   Обновить параметры: Best _ score ScoreV ; Р Р + 0,1;

    7:   конец если

    8:   если P < 1 то

    9:   Продолжить обучение;

    10:   еще

    11:   Завершить обучение;

    12:   конец если

    13: конец для

    В алгоритме 1 P — начальная вероятность выполнения полного смешивания; и – JS и DC в показателе точности обучения, полученном из каждой эпохи обучения; и являются JS и DC в индексе точности проверки, полученном в каждом раунде обучения.На 4-м шаге алгоритма по мере обучения значение P увеличивается шаг за шагом; то есть все большее количество изображений полностью смешивается, что приводит к небольшим колебаниям точности обучения. Таким образом, ScoreV немного ниже, чем Best_score, полученный из значения P предыдущего этапа, а диапазон уменьшения установлен равным 0,005. Обеспечение того, чтобы расстояние между ScoreT и ScoreV находилось в контролируемом диапазоне, предотвращает переоснащение модели.

    Конечное значение P находится в диапазоне от 0,1 до 0,9. Здесь верхний предел установлен равным 0,9, поскольку полное смешивание обучающих наборов приводит к недостаточному обучению исходного изображения моделью. Этот метод пошагового обучения может позволить модели обильно обучаться на исходных изображениях, а затем обучаться на изображениях полного смешения, что эквивалентно процессу постепенного обобщения модели.

    Сшивание результатов предсказания.

    При тестировании, чтобы сохранить исходный размер модели одинаковым, мы обрезаем тестовое изображение на участки размером 48 × 48 и устанавливаем шаг кадрирования равным 24, что позволяет несколько раз прогнозировать граничную часть каждого участка и повышает стабильность модели на границе патча.При выполнении сшивания результатов сегментации, поскольку шаг обрезки равен 24, во время сшивания несколько раз генерируются перекрывающиеся части. Затем мы усредняем значения вероятности соответствующих перекрывающихся частей в качестве конечного результата. Наконец, пиксели с прогнозируемым значением вероятности, большим или равным 0,5, используются в качестве ядерных пикселей.

    Сегментация перекрывающихся ядер

    В клинических исследованиях часто требуется количественный анализ различных клеточных морфологий на гистопатологических изображениях, поэтому простого разделения ядерных областей недостаточно.Следовательно, ядерные области должны быть точно сегментированы, чтобы определить границы каждого ядра. Однако из-за отсутствия очерченных границ между перекрывающимися ядрами необходим морфологический метод для дальнейшей сегментации границ ядер в полностью автоматическом конвейере.

    Общими этапами работы алгоритма водораздела являются окрашивание цветного изображения в серый цвет, построение карты градиента и сегментация водораздела на основе карты градиента для получения линии края сегментированного изображения.Когда начальная площадь охвата (т. е. минимальное значение площади) рассчитана, площадь ядер, полученная в результате сегментации переднего плана, подвергается преобразованию по расстоянию для извлечения морфологической центральной точки, а области стабильного цвета ядер, полученные в результате кластеризации вместе составляют первоначальные водосборные площади. Затем на основе этих областей алгоритм водораздела используется для получения результатов сегментации прилипших ядер.

    Результаты и обсуждения

    Сначала мы провели эксперименты по абляции основных тренировочных стратегий, предназначенных для проверки эффективности каждой стратегии.Во-вторых, предлагаемый метод сравнивается с традиционным методом сегментации машинного обучения на основе пикселей, чтобы доказать преимущества обучающего набора изображений, построенного с помощью обучения без учителя. Затем, чтобы отразить преимущества неконтролируемого построения обучающих выборок, его сравнивают с полностью контролируемым методом семантической сегментации. Наконец, проверяется влияние гибридного метода водораздела на сегментацию между ядрами.

    Исследование реализовано с помощью Python 3.7, а алгоритмы разработаны на основе платформы глубокого обучения Pytorch, которая в настоящее время является широко используемой библиотекой машинного обучения. Основными компонентами аппаратной среды являются процессор Intel (R) Core (TM) i7–8700K, 16 ГБ ОЗУ и графический процессор Nvidia Titan RTX.

    Выполнение эксперимента по абляции

    Чтобы проверить необходимость предложенной нами серии протоколов обучения, мы используем 20 исходных окрашенных HE изображений с искусственно аннотированными ядрами для тестирования, в то время как обучающие наборы и проверочные наборы автоматически захватываются неконтролируемым обучением.Разработанный эксперимент по абляции и экспериментальные результаты критериев сегментации показаны в таблице 2.

    Элементы операций в Таблице 2 — это протоколы обучения из предыдущего раздела. Кроме того, для сравнения с полным смешиванием добавляется общая операция смешивания, в которой обучающие изображения и метки смешиваются со случайными весами, соответствующими бета-распределению. Галочка в таблице указывает на то, что соответствующие операции выполняются в каждой строке.

    Из результатов видно, что значения ACC для разных операций очень близки.Это сходство возникает из-за того, что на изображениях менингиомы, окрашенных HE, безъядерные области обычно имеют большую долю во всем изображении, и для общей модели не составляет труда правильно сегментировать большинство безъядерных областей, что приводит к размыванию некорректных областей. сегментация ядерных областей. Значения PC и значения SP демонстрируют тенденцию к снижению из-за недостаточной способности к обобщению исходной модели, которая может идентифицировать только более темные окрашенные ядра на основе обучающих образцов, и эти области в основном являются правильными областями ядер, что приводит к более низкому FP.С дополнительными операциями способность модели к обобщению повышается, и она может различать слабо окрашенные ядра, что приводит к увеличению значения RC и значения F1. Это указывает на то, что способность модели к обобщению постепенно увеличивается с помощью нескольких операций, показанных в последней строке таблицы 2, а результаты сегментации переднего плана ядер, основанные на окончательных комбинированных операциях, показаны на рис. 5.

    Рис. 5. Результаты сегментации области ядра изображений менингиомы низкой и высокой степени злокачественности на основе как ручного, так и предложенного методов.

    , где оливковые области — это наземная правда, а области, окруженные тонкими зелеными линиями, указывают на результаты нашей ядерной сегментации.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0263006.g005

    Обратите внимание, что предлагаемый метод обучения с самоконтролем не требует нормализации цвета изображения до или после сбора обучающего патча, что позволяет для сохранения исходных цветовых характеристик и дополнительной экономии времени при подготовке тренировочного комплекта.

    Сравнение производительности сегментации с традиционными методами машинного обучения

    Обычно для сегментации патологических изображений используются два основных традиционных метода машинного обучения: классификация на уровне пикселей, основанная на SVM с учителем [6] и неконтролируемая иерархическая кластеризация K-средних [25].

    Мы разработали следующий эксперимент, чтобы сравнить эффект сегментации предлагаемого метода псевдометки с эффектом сегментации традиционных контролируемых и неконтролируемых методов: 1) Метод SVM: поскольку метод, описанный в [11], должен быть основан на одной и той же группе HE. -окрашенных изображений, мы случайным образом выбираем один процент от общего количества пикселей в изображении и его метки пикселей для обучения SVM, а затем используем обученную модель для предсказания каждого пикселя всего изображения до тех пор, пока не будут предсказаны все 20 тестовых изображений и рассчитывается средняя точность.2) Иерархический метод кластеризации K-средних аналогичен методу, описанному в исследовании [25]. Результаты индекса, полученные разными методами сегментации, приведены в таблице 3.

    Для традиционного метода сегментации машинного обучения, основанного на классификации пикселей, даже если добавлена ​​функция локальной области пикселя, корреляции между пикселями по-прежнему отсутствуют, поэтому этот метод требует некоторой морфологической постобработки для получения относительно полных ядерных областей.Между тем, предлагаемый метод требует только сплайсинга каждого патча без необходимости чрезмерной морфологической постобработки. Результаты сравнения показаны на рис. 6.

    Рис. 6. Сравнение результатов сегментации с результатами традиционных методов машинного обучения.

    Каждая строка представляет результаты сегментации, полученные разными методами, а каждый столбец представляет разные выборки. Оливковые области на изображении представляют наземную правду, а зеленая линия представляет собой результат ядерной сегментации с использованием соответствующего метода.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0263006.g006

    На рис. 6 показаны ограничения традиционного метода сегментации машинного обучения на основе пикселей. Отсутствие локального восприятия приводит к большому количеству неправильно сегментированных пикселей, поэтому для повышения точности сегментации требуется морфологическая постобработка. Кроме того, постобработка морфологии может легко привести к ситуации, показанной на рис. 6, образец 2. Цитоплазматическая область, окруженная несколькими ядерными областями, ошибочно классифицируется как ядерные области, что приводит к снижению точности ядерной сегментации.

    Сравнение производительности сегментации с контролируемой семантической сегментацией

    Чтобы создать обучающие наборы данных для контролируемого обучения, мы разделили 20 искусственно аннотированных окрашенных HE изображений на две части в соотношении 3:1, 15 для обучения и оставшиеся 5 для тестирования. Мы случайным образом берем более 200 000 обучающих фрагментов из 15 помеченных изображений, чтобы убедиться, что количество обучающих образцов такое же, как и в методе псевдометки. Наборы обучающих данных дополняются с помощью операций сдвига влево-вправо и вверх-вниз, вращения, отражения и масштабирования, а затем для сравнения используется модель U-Net и две ее улучшенные модели.После достаточного обучения тестовые изображения вводятся во все модели для прогнозирования.

    Результаты показаны в таблице 4, где AttU-Net означает Attention U-Net [26], а R2U-Net представляет рекуррентную остаточную сеть U-Net на основе CNN [24]. Экспериментальные результаты выявляют ограничения обучения с учителем, основанного на ручной маркировке, которая имеет ограниченную способность к обобщению, основанную на разнообразии ручной маркировки. Поскольку мы случайным образом выбрали 20 помеченных изображений из разных групп, существуют очевидные различия в цвете и ядерной морфологии изображений.Кроме того, обучающие изображения не нормализуются по цвету во время обучения, поэтому модели обучения с учителем сложно напрямую изучить особенности других 5 тестовых изображений из 15 обучающих изображений, что ограничивает точность, показанную в таблице 4. Сравнительные изображения результатов сегментации каждого метода показаны на рис. 7.

    Рис. 7. Сравнение результатов сегментации с методами контролируемой семантической сегментации.

    Каждая строка представляет результаты сегментации, полученные разными методами, а каждый столбец представляет разные выборки.Оливковые области на изображении представляют наземную правду, а зеленая линия представляет собой результат ядерной сегментации с использованием соответствующего метода.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0263006.g007

    Из образца 2, сегментированного AttU-Net, и образца 1, сегментированного R2U-Net на рис. 6, мы видим, что введение механизма внимания к усиливает AttU-Net изучает эффективные функции или используется рекуррентная нейронная сеть (RNN) и ResNet Структура интеграции R2U-Net, есть еще несколько изображений, которые не могут быть эффективно сегментированы.Этот сбой может быть связан с отсутствием похожих изображений в обучающем наборе, что означает, что модель не может эффективно изучить особенности таких изображений. В реальной задаче сегментации патологического изображения, окрашенного HE, качество изображений сильно различается, что затрудняет получение исчерпывающих данных ручной аннотации. Одним из решений является нормализация цвета изображений, окрашенных HE, чтобы цвет изображений был одинаковым. Это может снизить эффективность пакетной обработки изображений, но выбор эталонного изображения напрямую повлияет на качество общего нормализованного результата.

    Сравнение количества ядер

    Чтобы точно определить распределение и морфологию отдельных клеток в срезе, мы используем метод подсчета ядер для проверки сегментации ядер прикрепленных клеток, который также предоставляет статистические результаты для исследований по клинической диагностике или классификации. Мы случайным образом выбираем три изображения из тестовых изображений менингиомы высокой и низкой степени злокачественности соответственно в качестве образцов для подсчета, а затем отправляем их патологу для оценки статистики ядерных чисел.Из-за высокой плотности клеток в полном изображении патологоанатом делит каждое изображение на 16 (4×4) областей, каждая размером 384×512 пикселей, а затем эксперт выбирает четыре ROI для статистики на основе распределения клеток. . Количество ядер на всем изображении оценивается по принципу равномерного распределения клеток. Результаты сравнения между предложенным гибридным методом сегментации водоразделов и ручной статистикой показаны в таблице 5, в которой ручная статистика представляет результат ручного подсчета количества ядер, а «До» представляет статистические результаты до сегментации ядер адгезии, что является результатом прямого подсчета количества ядерных областей переднего плана, полученных предлагаемым способом.After представляет статистические результаты после сегментации Mixed Watershed, Rate представляет скорость увеличения количества ядер после добавления адгезионной сегментации ядер. Ошибка дает диапазон ошибок окончательной статистики после сегментации водораздела по сравнению со статистикой, полученной вручную.

    Применение сегментации смешанного водосбора оказывает относительно сильное влияние на количество ядер, наименьшее увеличение составляет более 25%, а большинство ошибок по сравнению с ручной статистикой составляет менее 10%, что показывает, что метод смешанного водосбора обладает способностью сегментировать прилипшие ядра.Подробные характеристики сегментации показаны на рис. 8, на котором показаны результаты сегментации трех исходных (1536 × 2048) изображений образцов, окрашенных HE. Из 2-уровневого увеличения мы видим, что большинство границ прилипших ядер точно найдены и сегментированы. Гибридный метод сегментации водораздела обеспечивает хорошую производительность, поскольку он может выбрать соответствующие точки локального минимума в соответствии с цветом ядра и надежной морфологией прилипшего ядра, а затем получить точную границу прилипшего ядра.Предпосылкой для этого метода является то, что метод сегментации, основанный на псевдометке, может более точно отделить ядерную область переднего плана от окрашенного HE изображения, что обеспечивает благоприятные условия для гибридного метода водосбора.

    Статистический анализ патологических особенностей менингиомы

    Количественная оценка результатов сегментации изображений, окрашенных HE, для вывода соответствующих патологических признаков является одним из важных шагов в анализе патологических изображений. Чтобы убедиться, что патологические признаки, основанные на результатах сегментации, оказывают вспомогательное влияние на классификацию менингиомы, мы количественно оценили сегментированные изображения, используя ряд патологических признаков, определенных в предыдущем исследовании [23], как показано в таблице 6, которые характеризуют состояние опухолевой ткани и может отражать прогрессирование опухоли [23].

    Поскольку во всех процессах обучения не использовались ручные аннотации, здесь нет необходимости рассматривать проблему утечки данных в глубоком обучении. Предложенный метод сегментации изображений ядер патологии менингиомы был применен в общей сложности к 60 группам из 300 изображений (30 групп из 150 для высокосортных и 30 групп из 150 для низкодифференцированных), а также к цитоплазматическим областям и внеклеточным интерстициальным областям. были временно сегментированы с использованием кластеризации K-средних. На основе результатов сегментации были подсчитаны наборы признаков в таблице 6, а некоторые результаты показаны в таблицах 7 и 8.

    Критерий суммы рангов Уилкокса использовался для проверки различий в характеристиках между менингиомами высокой и низкой степени злокачественности. Нулевая гипотеза: нет существенной разницы между статистическими характеристиками менингиом высокой и низкой степени злокачественности. Результаты испытаний в случае доверительной вероятности 0,95 представлены в таблице 9.

    Из Таблицы 9 видно, что, за исключением пропорции площади ECS, результаты всех других признаков меньше 0,05, что отвергает нулевую гипотезу.Причина, по которой доля ECS не прошла тест, заключается в том, что это не сама клетка, а влияние на аномальный рост ткани в основном отражается на клетке, а влияние на ECS относительно невелико. Поэтому изменения патологической картины менингиом разной степени злокачественности относительно незначительны. Поэтому в целом патологические признаки по результатам сегментации могут эффективно отражать различия в степени менингиом.

    Сравнение результатов сегментации общедоступных наборов данных

    Для дальнейшего тестирования эффективности обобщения предлагаемого метода мы проводим эксперименты по сегментации на общедоступном наборе данных MoNuSeg.Набор данных MoNuSeg [27] взят из конкурса Medical Image Computing and Computer Assisted Intervention (MICCAI) 2018 Multi-Organ Pathology Image Nucleus Segmentation Challenge, который включает 30 обучающих наборов и 14 тестовых наборов. Эти изображения поступают из разных больниц и охватывают образцы опухолевой ткани из разных органов, и их можно найти по следующей ссылке https://monuseg.grand-challenge.org/Data/.

    Чтобы обогатить количество обучающих выборок и уменьшить смещение результатов кластеризации из-за неравномерной окраски, мы устанавливаем окно размером 500 × 500 для случайного захвата блоков изображения из исходного изображения размером 1000 × 1000 и используем разработанную стратегию выбора выборки. на блоках изображения.В таблице 10 показаны результаты сравнения различных методов. Из значений в таблице видно, что предлагаемый метод обучения псевдометок без учителя достигает или превышает точность классической модели контролируемой семантической сегментации с точки зрения точности сегментации переднего плана ядра. Это также еще раз доказывает сильную обобщающую способность предлагаемого метода.

    Выводы

    В этой статье мы предлагаем полностью автоматизированный конвейер, основанный на псевдометках, для определения точных ядерных границ на окрашенных HE патологических изображениях менингиом, который фокусируется на автоматическом процессе генерации псевдометок и разрабатывает серию эффективные решения глубокого обучения для псевдометок.В качестве альтернативы ручному выбору обучающих выборок из фрагментов изображений HE предлагается стратегия неконтролируемого отбора, которая может автоматически и адаптивно захватывать обучающие выборки в соответствии с их характеристиками, что значительно повышает эффективность процесса обучения и совместимо с различными количествами и качеством изображений. . Затем структура глубокого обучения совершенствуется с помощью стратегий полного смешения и динамических эпох в процессе обучения. С помощью этой схемы можно предсказать даже не полностью окрашенные ядерные области на основе стабильно окрашенных ядерных областей.

    Предлагаемый метод показывает хорошие результаты в сравнительных экспериментах с методами контролируемой семантической сегментации и традиционными методами машинного обучения. Для методов контролируемой семантической сегментации, чтобы повысить обобщающую способность модели, необходимо получить как можно больше меток изображений с различными формами и цветами ядер, когда необходимо обработать новое изображение случая, его необходимо сначала помечается вручную, а затем строится обучающий набор для переобучения модели, чтобы модель имела возможность сегментировать новый случай, неизбежное ручное участие значительно снизит эффективность сегментации изображения.Однако предлагаемый метод может захватывать изображения обучающей выборки и их псевдометки в соответствии с установленной стратегией. Когда получен новый случай изображения, обучающие выборки и метки могут быть автоматически созданы на основе изображений для дальнейшего обучения модели, что повышает эффективность расширения модели. Для традиционных методов машинного обучения построение признаков с высокой репрезентативностью является сложной задачей, а способность классификации пикселей или суперпикселей получать локальную информацию об области, в которой находится пиксель, недостаточна.Предлагаемый метод использует патч изображения и сеть семантической сегментации для решения этих проблем.

    В дополнение к вышеперечисленным преимуществам, некоторые незначительные проблемы предлагаемых методов могут быть улучшены в будущем. Во-первых, относительно сложно сегментировать некоторые крупные скопления ядер правильной формы. Эти агрегации могут быть ошибочно приняты за целое ядро, а обучающие выборки с регулярными агрегациями могут отсутствовать. Поскольку такие скопления часто намного больше, чем отдельные ядра, особенность размера ядер будет учитываться в будущей структуре обучения, чтобы различать такие случаи.Во-вторых, некоторые крошечные нерелевантные точки сегментируются как ядра, которые могут быть стерты при постобработке после сегментации. В-третьих, после использования метода смешанного водораздела все еще есть несколько случаев недостаточной и чрезмерной сегментации. Принимая во внимание эти возможные улучшения, мы будем дополнительно направлять стратегию неконтролируемого отбора на выбор более надежных ядерных границ в качестве обучающих выборок, что повысит точность сегментации для более эффективных клинических исследований по анализу патологических изображений.

    Каталожные номера

    1. 1. Chen W, Zheng R, Baade PD, Zhang S, Zeng H, Bray F et al. Статистика рака в Китае, 2015 г. CA: Журнал рака для клиницистов, 2016 г., 66 (2): 115–132. пмид:26808342
    2. 2. Hu H, Liu YH, Xu L, Zhao JX, Duan XN, Ye JM и другие. Клинико-патологическая классификация и индивидуализированное лечение рака молочной железы. Китайский медицинский журнал, 2013 г., 126(20): 3921–3925. пмид:24157157
    3. 3. Гонг Л., Лю В., Дин Ю., Гэн Ю., Сунь Х., Хуан Х.Диагностика и дифференциальная диагностика десмопластической фибробластомы с помощью клинических, рентгенологических и гистопатологических анализов. Китайский медицинский журнал, 2018 г., 131(1): 32–36. пмид:29271377
    4. 4. Lopez C, Lejeune M, Bosch R, Korzynska A, Jaen J. Цифровой анализ изображений при раке молочной железы: пример автоматизированной методологии и эффекты сжатия изображений. Исследования в области медицинских технологий и информатики, 2012 г., 179: 155–171. пмид:22925796
    5. 5. Лу С., Махмуд М., Джа Н., Мандал М.Надежный метод автоматической сегментации ядер для количественного анализа гистопатологических изображений. Анальный квант цитопато, 2012, 34: 296–308. пмид:23304815
    6. 6. Tareef A, Song Y, Huang H, Feng D, Chen M, Wang Y. Многопроходный быстрый водораздел для точной сегментации перекрывающихся клеток шейки матки. IEEE Trans Med Imag, 2018, 37: 2044–2059. пмид:29993863
    7. 7. Zhang X, Xing F, Su H. Высокопроизводительный анализ гистопатологических изображений с помощью надежной сегментации клеток и хеширования.Med Image Anal, 2015, 26: 306–315. пмид:26599156
    8. 8. Тахери С., Февенс Г.Т., Буй Д.Т. Надежная сегментация ядер на цито-гистопатологических изображениях с использованием подхода набора статистических уровней с ограничением сохранения топологии. Материалы SPIE Medical Imaging, Флорида, 2017 г.
    9. 9. Cui Y, Hu J. Саморегулирующаяся сегментация ядер (SANS) окрашенных гематоксилин-эозином гистопатологических изображений рака молочной железы. Материалы Международной конференции IEEE по биоинформатике и биомедицине (BIBM) 2016 г., Шэньчжэнь, 2016 г.
    10. 10. Миттал Х., Сарасват М. Метод автоматической сегментации ядер с использованием интеллектуального алгоритма гравитационного поиска на основе суперпиксельной кластеризации. Swarm Evol Comput, 2019, 45: 15–32.
    11. 11. Qu A, Chen J, Wang L, Yuan J, Yang F, Xiang Q и др. Сегментация окрашенных гематоксилином-эозином гистопатологических изображений рака молочной железы на основе попиксельного классификатора SVM. Sci China Inf Sci, 2015, 58: 1–13.
    12. 12. Шелхамер Э., Лонг Дж., Даррелл Т.Полностью сверточные сети для семантической сегментации. IEEE Trans Pattern Anal Mach. Интелл, 2017, 39: 640–651. пмид:27244717
    13. 13. Chen H, Qi X, Yu L, Dou Q, Qin J, pheng H. DCAN: глубокие сети с учетом контуров для сегментации экземпляров объектов по гистологическим изображениям. Med Image Anal, 2017, 36: 135–146. пмид:27898306
    14. 14. Цюй Х., Ян З., Ридлингер М.Г., Де С., Метаксас Д.Н. Улучшение сегментации экземпляров ядер/желез в гистопатологических изображениях с помощью нейронной сети с полным разрешением и пространственной ограниченной потери.Материалы 22-й Международной конференции по обработке медицинских изображений и компьютерным вмешательствам (MICCAI), Шэньчжэнь, 2019 г.
    15. 15. Роннебергер О., Фишер П., Брокс Т. U-Net: сверточные сети для сегментации биомедицинских изображений. Материалы 18-й Международной конференции по обработке медицинских изображений и компьютерным вмешательствам (MICCAI), Мюнхен, 2015 г.
    16. 16. Pan X, Li L, Yang D, He Y, Liu Z, Yang H. Алгоритм точной сегментации ядер в патологическом изображении на основе глубокой семантической сети.IEEE Access, 2019, 7: 110674–110686.
    17. 17. Zeng Z, Xie W, Zhang Y, Lu Y. RIC-Unet: улучшенная нейронная сеть на основе Unet для сегментации ядер в гистологических изображениях. IEEE Access, 2019, 7: 21420–21428.
    18. 18. Цзян Х, Ван И, Чжан Дж, Чанг Ф, Сюэ Х, Ван Х и др. Патологическая классификация и иконография менингиом. Int J Neurol Neurosur, 2012, 6: 511–514.
    19. 19. Кокс Дж.А. МЕТОДЫ ОКРАШИВАНИЯ: гистологический и гистохимический.СА Медицина, 1961, 94: 277.
    20. 20. Strzelecki M, Szczypinski P, Materka A, Klepaczko A. Программный инструмент для автоматической классификации и сегментации 2D/3D медицинских изображений. Ядерные приборы и методы в физических исследованиях А, 2013, 702: 137–140.
    21. 21. Sun T, Neuvo Y. Сохраняющие детали срединные фильтры при обработке изображений. Письма о распознавании образов, 1994, 15: 341–347.
    22. 22. Ван Влит Дж.Л., Янг ТИ, Вербек В.П. Рекурсивные фильтры производных Гаусса.Материалы четырнадцатой международной конференции по распознаванию образов (ICPR), Брисбен, 1998 г.
    23. 23. Ши П., Чен Дж., Лин Дж., Чжан Л. Высокопроизводительная количественная оценка жира на гистопатологических изображениях печени, окрашенных гематоксилин-эозином, на основе попиксельной кластеризации. Sci China Inf. Наука, 2017, 60: 12.
    24. 24. Алом З.М., Якопчич С., Таха М.Т., Асари В.К. Сегментация ядер с помощью повторяющихся остаточных сверточных нейронных сетей на основе U-Net (R2U-Net). Материалы Национальной конференции IEEE по аэрокосмической отрасли и электронике (NAECON), Дейтон, 2018 г.
    25. 25. Ши П., Чжун Дж., Хуан Р., Лин Дж. Автоматизированный количественный анализ изображений препаратов, окрашенных гематоксилином-эозином при лимфоме, на основе иерархической кластеризации K-средних. Материалы 8-й Международной конференции по информационным технологиям в медицине и образовании (ITME), Фучжоу, 2016.
    26. 26. Октай О., Шлемпер Дж., Фолгок Л.Л., Ли М., Генрих М., Мисава К. и др. Внимание U-Net: учимся, где искать поджелудочную железу. материалы медицинской визуализации с глубоким обучением (MIDL), Амстердам, 2018 г.
    27. 27. Кумар Н., Верма Р., Ананд Д., Чжоу Ю., Ондер О.Ф., Цугэнис Э. и др. Задача сегментации многоорганного ядра. IEEE Transactions on Medical Imaging, 2020, 39(5): 1380–1391. пмид:31647422
    28. 28. Фейсал М., Дэниел Б., Ричард Дж. К., Грегори Н. М., Кеван Дж. С., Александр Б. и др. Глубокая состязательная тренировка для сегментации ядер нескольких органов на гистопатологических изображениях. IEEE Transactions on Medical Imaging, 2020, 39(11): 3257–3267.
    29. 29. Ван Х, Цао П, Ван Дж, Зайан О Р.Uctransnet: переосмысление пропускных соединений в u-net с точки зрения канала с помощью трансформатора. 36-я конференция AAAI по искусственному интеллекту, Ванкувер, 2021 г.
    30. 30. Виджай Б., Алекс К., Роберто С. SegNet: Архитектура глубокого сверточного кодера-декодера для сегментации изображений. IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence, 2017, 39(12): 2481–2495.

    Система для количественной оценки цифровых изображений биопсии рака молочной железы, окрашенных DAB&H (CHISEL)

    Оптимизация

    Мы протестировали четыре схемы извлечения пластыря.Схемы сравнивались по эффективности и временным затратам. Оценка эффективности основывалась на показателях TPR, PPV и F1 (рис. 5, слева), а эксперимент проводился с набором данных IISPV с размером ROI, установленным на 250 пикселей. Как правило, ROI должны быть больше, но размер аннотированных изображений требует уменьшения их размера. ANN_ROI, использованная в схемах A, B и C, была обучена на 40 000 аннотированных ROI и показала точность 74,3% при распознавании сильно размытых и пустых ROI.

    Для оценки времени мы рассматривали реализацию blockproc как эталонный метод, поэтому все представленные результаты являются относительными (рис. 5, справа). Для оценки времени мы протестировали его на двух размерах изображений: типичных относительно небольших обрезанных изображениях размером \(1000\x 1000\) пикселей и разделенных ядрах TMA размером \(16{,}000\x 13{,}000\ ) пикселей.

    Рисунок 5

    Сравнительные результаты схем извлечения пластырей, предложенных в этом исследовании. (слева) Сравнение показателей эффективности обнаружения.(справа) Оценка времени относительно метода blockproc . Были протестированы изображения двух размеров: ump_img (одно ядро ​​TMA) размером \(16{,}000\times 13{,}000\) пикселей и small_img (относительно небольшое обрезанное изображение) размером \(1000 \умножить на 1000\) пикселей.

    Есть два основных параметра CHISEL, которые определяют эффективность обнаружения ядер. Первый — это пороговый параметр алгоритма сегментации, который определяет локальный относительный уровень отсечки интенсивностей в обрабатываемом окне, и его актуальность была установлена ​​в более раннем исследовании 54 .Другой — параметр T рекурсивной локальной обработки алгоритма разбиения кластера, влияющий на количество необходимых повторений. Более низкие значения параметра T лучше подходят для плотно упакованных кластеров, но время обработки увеличивается, как показано в предыдущем эксперименте 58 . Эти настраиваемые параметры были скорректированы для оптимизации производительности CHISEL. Мы использовали двойную перекрестную проверку для настройки параметров в эксперименте. На рис. 6 показаны две кривые точности и полноты.Первая кривая была построена путем изменения значения порогового параметра алгоритма сегментации (рис. 6, слева), а другая была построена путем изменения значения параметра T рекурсивной локальной обработки алгоритма разделения кластера (рис. 6). , правильно). Пороговые значения были выбраны эмпирически, чтобы максимизировать балл F1 в наборе данных. В результате CHISEL оптимизирован для разрешения изображений и размера ядер, и его можно успешно использовать на новом наборе данных с аналогичными характеристиками.

    Рисунок 6

    Кривые точности-отзыва для настройки параметров CHISEL. Изолинии обозначают области с разными оценками F1. (слева) Кривая создается путем изменения значения порогового параметра алгоритма сегментации. (справа) Кривая создается путем изменения значения параметра T алгоритма разделения кластера.

    Последняя часть структуры CHISEL, ИНС, которая классифицирует объекты, была оптимизирована путем анализа влияния количества слоев, числа нейронов и функций активации на результаты классификации.Были протестированы сети с 1, 2 и 3 скрытыми слоями, тем не менее одиночный скрытый слой вполне достаточно ответил на поставленную задачу. Следуя правилу минимально необходимых требований, мы оставили только один скрытый слой. Точность классификации постоянно превышала 97% независимо от количества нейронов в скрытом слое, тестировалась в диапазоне от 10 до 20, при этом снижалась при меньшем количестве нейронов. Кроме того, были протестированы несколько функций активации, и было установлено, что они оказывают минимальное влияние на результат.Наконец, этот классификатор состоит из одного скрытого слоя с 20 нейронами с сигмовидной функцией активации, а выходной слой представляет собой софтмакс с двумя выходными классами: иммуноположительные и иммуноотрицательные ядра.

    Обучение ИНС было основано на типичной схеме с разделением примеров 70/15/15 для обучения, проверки и тестовых подмножеств. Слои сети были инициализированы с помощью функции инициализации слоя Нгуена-Видроу. Для обучения использовался масштабированный алгоритм обратного распространения сопряженного градиента, а функция кросс-энтропии была рассчитана для оценки производительности сети.Обучение было установлено на 1000 эпох, где одна эпоха обучения определяется как однократное представление всех входных векторов в сеть. Сеть (веса и смещения) обновляется соответственно после каждой эпохи. В заключение классификация привела к средней точности 99,2%, которая была протестирована с пятикратной перекрестной проверкой.

    Сравнительная визуальная оценка

    Мы измерили производительность системы на микроскопических изображениях из двух наборов данных, сравнив их обработанные результаты с аннотированными основными правдами.Производительность была подтверждена визуально, а также с использованием ранее описанного метода оценки с оценкой PPV, TPR и F1.

    Как показано на рис. 7, предложенный алгоритм отлично выполняет разбиение кластеров. Иммунопозитивные ядра были правильно разделены только с помощью CHISEL (представлены в столбце «crop1»). Для сравнения, Tmarker показал несколько пропущенных обнаружений, хотя его классификация казалась правильной. Методы Unet и IHCtoolbox давали только результаты обнаружения (отсутствие дискриминации между классами), поэтому все объекты были отмечены одним (белым) цветом.И наоборот, метод Qupath обнаружил слишком много объектов по сравнению с доступной наземной истиной.

    Рисунок 7

    Визуальное сравнение конкретных результатов пяти различных методов. Основная истина: зеленые метки = иммуноотрицательные ядра; красные метки = иммуноположительные ядра. В результатах: серая область – объект, классифицированный как иммунонегативный; белая область представляет собой объект, классифицируемый как иммуноположительный. Методы IHCtoolbox и Unet позволяли обнаруживать только ядра, поэтому все объекты представлены белым цветом.

    Количественное сравнение результатов

    Полезность предложенной схемы была проверена путем ее сравнения с другим современным программным обеспечением для количественной оценки в гистопатологии, которое доступно онлайн, а также с методами DL.

    Таблица 1 Результаты обнаружения и обнаружения с последующей классификацией CHISEL и другими современными методами на основе обработки набора данных IISPV.

    Сравнение предложенной схемы с вышеуказанными методами, основанными на обработке набора данных ИИСПВ, представлено в таблице 1.Для сравнения с Qupath, эксперт, имеющий опыт работы с этим программным обеспечением, вручную настроил параметры обработки для достижения наилучших результатов. В случае с этим набором данных мы оценили эффективность обнаружения, а также идентификации иммунопозитивных и иммунонегативных ядер.

    С точки зрения обнаружения ядер наивысшая оценка F1 была достигнута с помощью CHISEL. Qupath превзошел CHISEL с точки зрения TPR, но с низким PPV его окончательный балл F1 был ниже. Напротив, IHCtoolbox имел очень высокий PPV, но низкий TPR и, следовательно, имел более низкий показатель F1, чем CHISEL.Метод Чена DL также заслуживает внимания, поскольку он показал довольно хорошие общие результаты.

    Помимо предложенного метода, только Qupath и Tmarker позволяли проводить встроенную дискриминацию между иммунопозитивными и иммунонегативными ядрами. Результаты для иммунопозитивных ядер были очень похожи на результаты обнаружения, как описано выше. Однако в случае иммунонегативных ядер метод CHISEL показал более высокие значения по всем показателям.

    В таблице 2 представлено сравнение предложенной структуры с другими методами, основанными на наборе данных Warwick Beta Cell Dataset.Производительность обнаружения предлагаемого метода сравнивалась с ранее упомянутыми методами. Кроме того, мы представляем оригинальные результаты авторов, создавших этот набор данных, непосредственно из их опубликованной статьи 11 . Поскольку эти два метода локализуют только бета-клетки, мы относимся к ним как к методам обнаружения с классификацией. В наборе данных Warwick Beta Cell Dataset наземная правда была предоставлена ​​​​в виде набора бинарных масок, соответствующих каждому изображению, содержащих точечные маркеры, слитые из меток, сделанных тремя экспертами.Поскольку была предоставлена ​​только маркировка ядер бета-клеток, эффективность этих методов при обнаружении объектов, отличных от бета-клеток, не могла быть оценена. Этот набор данных довольно сложен для задачи обнаружения. Только CHISEL и IHCtoolbox достигли TPR выше 0,5, в то время как все остальные методы показали очень плохой PPV. Включение классификации в структуру CHISEL значительно улучшило его оценку F1, поскольку его PPV стал самым высоким. Метод Lipsym показал наибольшее значение TPR, но его более низкий PPV привел к более низкому показателю F1 по сравнению с методом CHISEL.

    Таблица 2 Результаты обнаружения и обнаружения с последующей классификацией CHISEL и другими современными методами, основанными на обработке набора данных Warwick Beta Cell Dataset.

    Обсуждение результатов

    Основной целью схемы CHISEL, представленной в данной статье, является автоматический количественный анализ ядер в образцах тканей, окрашенных ИГХ. Поскольку основной целью предлагаемой схемы была эффективная и точная сегментация ядер клеток в гистопатологических срезах, окрашенных IHC с помощью DAB&H, мы использовали набор данных IISPV ткани из биопсии больных раком молочной железы, в которой использовались маркеры Т-клеток, как наши первичные данные для оценки.Как показано в таблице 1, метод CHISEL показал в целом наилучшие результаты, что подтверждается его лучшим результатом F1. Видно, что TPR Qupath был выше, но его производительность уступала из-за плохого PPV.

    Чтобы дополнительно установить актуальность предложенной схемы, мы оценили результаты, полученные при обработке набора данных бета-клеток Warwick для окрашенных DAB&H тканей пациентов с посмертным диабетом. Работа с этим набором данных потребовала настройки параметров фреймворка, но это было довольно легко и не заняло много времени.Интересующие объекты в наборе данных Warwick были достаточно похожи с точки зрения контраста и интенсивности окрашивания, хотя и были примерно в два раза меньше, чтобы упростить настройку.

    Как показано в таблице 2, наша структура показала удовлетворительные результаты с этим набором данных. Первоначальная плохая PPV CHISEL при обнаружении была значительно улучшена, когда также была учтена классификация. Этот подход показал лучший показатель F1 среди протестированных методов, с немного большим влиянием на PPV, чем на TPR. Для сравнения, метод Lipsym (со вторым лучшим показателем F1) уравновешивал TPR и PPV, но влияние было доминирующим на TPR.

    Основной проблемой, с которой мы столкнулись при работе с набором данных Warwick Beta Cell Dataset, была огромная разница между экспертами. Сравнение меток, сделанных тремя экспертами, друг с другом и со слитой наземной истиной показало, что их чувствительность и PPV не превышают 65%. Это доказывает сложность интерпретации человеком изображений в этом наборе данных. Это также может быть причиной того, что наши и другие методы не превышают производительность человеческого уровня.

    CHISEL против глубокого обучения

    Сравнение предложенного рабочего процесса с методами глубокого обучения выявило интересный факт. Обещанная надежность DL по-прежнему недостижима, и в большинстве случаев модели приспособлены для обработки определенного набора данных. Методы глубокого обучения, которые, кажется, полностью опережают обработку изображений, не очень хорошо работают в этом сценарии. Классификация различных видов образцов раковой ткани может быть выполнена с помощью глубоких нейронных сетей. Однако точная количественная оценка ядер остается сложной проблемой даже для алгоритмов DL 64 .В основном это связано с отсутствием общедоступных наборов данных с аннотированными изображениями IHC. Существует множество помеченных наборов данных изображений H&E, но в предыдущем исследовании мы доказали, что модель DL, предварительно обученная на изображениях H&E, не превосходит наш метод обнаружения 54 . Это исследование показало, что с очень небольшим количеством аннотированных изображений IHC легче настроить параметры классического рабочего процесса обработки изображений, чем обучать модель DL.

    Кроме того, одной из основных проблем с применением метода глубокого обучения в клинической практике является то, что клиницисты не доверяют моделям нейронных сетей из-за их строения «черного ящика» и потому, что «система здравоохранения не хочет полностью доверять машине задачу, которая человек может сделать, даже если есть существенная экономия времени» 65 .

    Более того, даже вывод (по сравнению с обучением) сложной модели глубокого обучения требует мощной машины, что довольно дорого. Администраторы медицинского сектора не всегда считают этот ресурс приоритетным. Конечно, это не так в развитых странах, но медицинские пункты с ограниченными ресурсами все еще есть во всем мире. Наш метод был подготовлен для полного использования доступной вычислительной мощности, но при этом был доступен для пользователей с меньшими ресурсами. Это увеличивает доступность, а также полезность нашей реализации.

    Преимущества CHISEL

    Общие хорошие характеристики CHISEL можно объяснить несколькими важными концепциями, использованными при разработке метода. Ранее мы установили 54 , что метод, используемый для начальной сегментации, имеет высокую чувствительность как для иммунопозитивных, так и для иммунонегативных ядер, в то время как его специфичность может быть неудовлетворительной. Однако идея объединения этого приличного алгоритма обнаружения с классификацией объектов позволяет достичь хорошей производительности, о чем свидетельствуют результаты, представленные в таблице 1.Кроме того, было доказано, что начальное обнаружение ядер с последующим явным этапом разделения кластеров и уточнением границ в CHISEL улучшает количественную оценку 57,58 . Кроме того, поскольку широко популярный алгоритм цветовой деконволюции может привести к дополнительным неточностям в сегментации ядер 66 , мы решили использовать цветовое пространство HSV на основе результатов нашего предыдущего исследования 54 при сравнении эффективности пороговой обработки на различных типах монохроматических изображений. (отдельные каналы из разных цветовых пространств).

    Кроме того, извлечение фрагментов на основе предварительно рассчитанного местоположения ROI и метод сборки результатов из нескольких перекрывающихся ROI предназначены для бесшовного прогнозирования ядер в больших изображениях всего предметного стекла. Этот подход облегчает правильную сегментацию ядер вблизи границы области интереса, поскольку любой пороговый метод (и особенно адаптивные пороговые методы, используемые в этой структуре) неправильно обрабатывает объекты, находящиеся вблизи края изображения. Из-за своего уменьшенного размера и искаженной формы частично видимые ядра вблизи границы изображения могут негативно влиять на процесс классификации.С нашим подходом эта проблема сводится на нет.

    Сравнение предложенных схем с точки зрения бесшовной обработки показало аналогичные результаты в соответствии с их оценкой F1, с лишь небольшим увеличением оценки F1 в случае более смещенных ROI, как показано на рис. 5. Это может быть вызвано настройки эксперимента. В этом эксперименте мы в первую очередь сосредоточились на времени обработки и чрезмерно уменьшили ROI (до 250 пикселей, чтобы она соответствовала \(1000\x 1000\) изображений), что привело к уменьшению количества перекрывающихся областей.Это создает условия, при которых трудно добиться улучшения оценки F1, и это не показывает реальную ценность предлагаемых схем. В случае изображений всего слайда повышение точности должно быть более отчетливым, но, к сожалению, у нас нет полностью размеченных изображений всего слайда для численной оценки точности.

    Для небольших изображений базовая функция обработки блоков (метод blockproc , который рассматривался как эталон для оценки времени обработки) работает быстрее, чем предлагаемые схемы.Это может быть вызвано оптимизированной обработкой памяти встроенной функцией. Мы предполагаем, что упрощение обработки изображений делает нашу схему более быстрой для больших изображений. Как показано на рис. 5, предложенная схема извлечения фрагментов ускоряет обработку при сохранении аналогичного уровня точности для больших изображений кернов из ТМА; особенно ожидается дальнейшее улучшение этого отношения для WSI. Как и ожидалось, схема А оказалась самым быстрым решением. Хотя схемы B и C увеличивают область обработки за счет двойной проверки границ изначально выбранных ROI, они также увеличивают время обработки.Схема B, кажется, балансирует между временем обработки и ожидаемым увеличением точности, и, следовательно, она была использована в реализации CHISEL.

    В предлагаемой структуре изображения, которые слишком велики для размещения в памяти, разбиваются на более мелкие и обрабатываются партиями в соответствии с многопроцессорной способностью используемой машины. Это способствует масштабируемости метода; его можно использовать как на высокопроизводительной вычислительной машине, так и на обычном персональном компьютере. Таким образом, такой подход позволяет использовать эту структуру даже в экономически менее развитых странах.

    Кроме того, как указывалось ранее, подход CHISEL основан на обнаружении всех ядер в обработанном изображении (с классификацией, чем на более позднем этапе). Этот способ обработки отличается от большинства программ для количественного определения ядер, но имеет важное преимущество. Таким образом, CHISEL больше подходит для исследования тканей, где соотношение иммунопозитивных и иммунонегативных ядер является диагностическим фактором. CHISEL предоставляет эту информацию при однократном просмотре изображения. Естественно, типичное количество ядер на площадь также легко рассчитывается на основе результата CHISEL.

    Кроме того, на основе сравнения основных характеристик формы ядер (раздел «Наборы данных») и окончательных результатов нашего метода на обоих наборах данных мы можем предположить, что CHISEL достаточно надежен в адаптации к различным изображениям. Поскольку не существует универсального метода, который можно было бы применить к любой задаче в цифровой патологии, мы даем возможность настроить параметры CHISEL, чтобы максимизировать его производительность. Двумя основными параметрами являются порог алгоритма сегментации и параметр T рекурсивной локальной обработки алгоритма разделения кластера (оптимизация обоих описана в разделе «Оптимизация»).Обнаружение является важным шагом, и очень важно успешно сегментировать все ядра. Настройка значения порога алгоритма сегментации в основном основана на контрасте между ядрами и их окружением. С другой стороны, значение параметра T вместе с пределом проверенных максимальных повторений алгоритма разделения кластеров, которые можно настроить в графическом пользовательском интерфейсе CHISEL, связано со сложностью кластеров, присутствующих в анализируемых изображениях.Помимо этих параметров мы включили возможность изменять размер ROI и размер перекрытия между ними. Также различение мелких объектов (по умолчанию менее 50 пикселей), выполняемое на этапе постобработки, может быть скорректировано, если размер интересующих объектов меньше, чем в представленных наборах данных.

    Недостатки ДОЛОТО

    Как и у любого метода, у нашего решения также есть недостатки. Алгоритм адаптивной пороговой обработки, используемый в CHISEL, плохо работает, если два ядра с разной интенсивностью слипаются вместе.Это происходит, когда иммуноположительные и иммуноотрицательные ядра расположены очень близко друг к другу, как показано на рис. 7 (столбец «crop3»). Ядро с более светлой интенсивностью часто рассматривается как фон по отношению к более темному ядру рядом. Кроме того, хотя алгоритм разделения кластеров был разработан специально для таких типов выборок, он неэффективен при разделении кластеров с небольшими вогнутыми участками, как показано на рис. 7 (столбец «crop2»).

    Не существует универсального метода обработки всех изображений.Ни классический, ни метод, основанный на глубоком обучении, не могут успешно определять количество ядер в различных цифровых изображениях биопсии. Основным недостатком классического подхода к обработке изображений, такого как этот, является необходимость ручной настройки параметров для новых данных.

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.